高中生物“基因工程”教学中几个常见问题的探讨

钱雪梅

（南京外国语学校 江苏南京 210008）

现代社会中，生物学科学发展迅猛，基因工程技术也是日新月异。基于基因工程这部分内容在高中教材中的呈现、高考要求，下面对几个高频出现的问题做了整理和简要阐述。

（1）自然界中的农杆菌侵染植物细胞时，只将其内部Ti质粒中的一段T-DNA侵入并整合到植物细胞中的染色体上，其自身并不侵入植物细胞中，有什么意义？

农杆菌侵染的主要是双子叶植物和裸子植物，当植物体细胞受损伤时，损伤的部位分泌出酚类物质，如乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮等物质。这些酚类物质可诱导农杆菌中的Ti质粒中的Vir基因的表达，且表达的一部分产物参与将Ti质粒上T-DNA片段的一条链切下，另一部分产物即与该单链T-DNA形成复合物，保证复合物的稳定性，同时促进其侵入植物细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上。当其T-DNA成功插入植物细胞的染色体组后，其在植物细胞中表达并产生大量的生长素、细胞分裂素及冠瘿碱等物质。激素类物质可促进受伤部位的细胞大量增殖形成冠瘿瘤，冠瘿碱从瘤细胞中分泌出去作为农杆菌的碳源和氮源，同时冠瘿碱有利于农杆菌吸附于植物细胞壁上，更有利于其得到更多的有机物，从而更好地进行繁殖。

（2）构建基因表达载体时，在目的基因前后加装的启动子和终止子是如何选择的?

启动子和终止子是基因表达时RNA聚合酶的识别位点。在体外构建基因表达载体时，启动子和终止子通常是已经安装在载体上，只需将目的基因的片段插入到载体中特定的启动子和终止子之间即可。启动子和终止子的选择直接影响目的基因在受体细胞中的表达效率。科研人员通常是根据目的基因受体细胞类型，如特定类型的细胞或特定发育阶段的细胞来确定。例如，CMV启动子是启动真核基因表达的强有力启动子，被广泛应用于构建真核表达载体；而构建原核表达载体常用的是T7启动子；若仅让目的基因在神经元中表达，则可选用神经元特异性启动子（NSE、SYN等）。除此之外，还可选择受体细胞中特定时空表达的基因启动子和终止子装入表达质粒中，从而实现目的基因的时空特异性表达。例如，将人的胰岛素基因先导入牛的受精卵中，欲让其在乳腺细胞中表达，则通常选择牛的乳腺蛋白基因的启动子和终止子装载到表达质粒中。

（3）通过反转录法合成目的基因需用逆转录酶，还需要DNA聚合酶吗？

获取目的基因的方法有多种。方法之一是以目的基因的mRNA为模板通过反转录法合成目的基因，此过程中用到的酶是逆转录酶，不需要DNA聚合酶参与。大多数反转录酶都具有多种酶活性，功能强大。主要包括以下几种活性：①DNA聚合酶活性：以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程；②RNase H活性：反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，由RNase H从RNA 5′端水解RNA链，此过程也由逆转录酶完成；③DNA指导的DNA聚合酶活性：以反转录合成的DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成互补的DNA链，从而可得到一条双链DNA分子，此过程也由逆转录酶完成。除此之外，有些逆转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因能整合到宿主细胞染色体DNA中有关。逆转录酶的发现对于基因工程技术起了很大的推动作用，它已成为一种重要的工具酶在基因工程的具体操作得到广泛应用。

（4）如何在人工合成的目的基因中加入限制性核酸内切酶的酶切位点？

通过反转录法获取的目的基因不含有限制酶识别的序列，那如何将目的基因顺利地装载到载体上去的呢？通常是在对目的基因进行PCR扩增时，在设计的目的基因引物的两端分别加装两种限制酶的识别序列，限制酶识别的序列加在引物的5′端。将这两种引物加入扩增体系中，通过PCR技术扩增得到的目的基因的两端即含有两种限制酶的酶切序列，将来用特定的两种酶识别切割后，在目的基因的两端即有特定的黏性末端，构建基因表达载体时即可与载体形成正向连接的有效表达载体。

例如，用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图1所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图2所示的类型片段。

图1 引物Ⅰ、Ⅱ与DNA的连接示意图

图2 扩增后的大部分DNA片段示意图

利用PCR技术对DNA分子中的A1片段扩增时，当引物与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸总是从5′端到3′端。通过两轮复制后即可得到图2的片段，经过若干轮的复制后得到的DNA片段大多是此类。若在PCR扩增时，在引物I的5′加装另一种酶切序列，则该片段的两端即有两种限制酶切序列，加装有两种限制酶切序列的目的基因在构建基因表达时将被有效利用。

（5）科研工作者在构建基因表达载体时为何常用双酶切法处理目的基因和载体？

在构建基因表达载体时常用到酶切和酶连的方法，酶切方法包括单酶切和双酶切。若用同一种限制酶对目的基因和载体进行单酶切，得到的目的基因和载体两端酶切末端相同，将会出现目的基因和载体的首尾相连即自身环化现象；目的基因与质粒的正向与反向连接等现象。自身环化后的DNA片段的出现将大大降低重组质粒的形成，而且重组质粒中反向连接的机率有50%，目的基因正向连接的表达载体能正常表达产生预期效果，若反向连接目的基因表达时RNA聚合酶进行转录时正好是将基因的模板链的互补链为模板转录出mRNA，将不可能翻译出正常的蛋白质。为了提升目的基因和载体的正向连接的成功率，基因工程的具体操作中常用双酶切法来构建基因表达载体。双酶切即采用两种不同的限制酶（非同尾酶、同功酶）同时对目的基因和载体进行切割，这样有效防止被切割后的目的基因和载体的自身环化现象，目的基因和载体正确连接形成表达载体的比例大大提高。双酶切法已被广泛应用于基因表达载体的构建过程中。

（6）基因工程中为何在同一载体上设计装载两个标记基因？

运载体上的标记基因是为了鉴定和筛选导入目的基因的重组细胞。这里以目的基因插入到pBR322的BamH I位点中为例来加以说明：图3是pBR322质粒结构示意图，在pBR322质粒含有两个抗生素抗性基因（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）；还有单一的BamH I的识别位点。

图3 pBR322质粒结构示意图

在将此质粒载体用BamH I酶切后，与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的连接产物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有含有环状目的基因、含有普通质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌3种。

那么，如何从以上多种混合的大肠杆菌中筛选得到所需的含有目的基因的受体细胞呢？此时，通常是利用两种抗生素的抗性基因的特点进行筛选。首先将转化的大肠杆菌涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，只有导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌能在培养基上生长，而没有被转化的大肠杆菌和只被环形目的基因转化的大肠杆菌会全部死亡。又由于BamH I位点位于四环素的抗性基因中，插入目的基因后就会破坏四环素的抗性基因，四环素的抗性会消失，所以成功导入重组质粒的大肠杆菌将不抗四环素。接着，把生长在含有氨苄青霉素的培养基上的大肠杆菌通过影印法移到含有四环素的培养基上进行克隆化培养，若在含有四环素的培养基上仍能正常的大肠杆菌则导入的是普通质粒的细菌，而不能生长的则应是导入了重组质粒的大肠杆菌，这些才是成功导入了目的基因的大肠杆菌。据此可以将两个培养皿进行对照，再从第一培养皿中挑选出相应的大肠杆菌进行培养，得到所需的受体细胞。其实导入重组质粒的大肠杆菌中也有一半是无效的，因为目的基因的两端黏性末端是相同的，然后再利用稀释涂布培养大肠杆菌，根据培养结果进行判断。

（7）标记基因和报告基因之间有什么区别与联系？

标记基因（marker gene）是一种已知功能或已知序列的基因，其编码产物能够使转化的细胞、组织具有对抗生素等的抗性，或者使转化细胞、组织具有代谢的优越性。常用的标记基因是一些抗生素抗性基因，如在培养基中加入抗生素等选择试剂的条件下，非转化的细胞死亡或生长受到抑制，而转化的细胞能够继续存活，从而将转化的细胞、组织从大量的细胞或组织中筛选出来。标记基因通常用来检验转化成功与否。

报告基因（reporter gene）是一种编码产物容易被检测与鉴定的基因，已被克隆且全序列已测定，在受体细胞中不存在、也无相似内源性表达产物。通常要把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或者与目的基因连接成融合基因，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。因此，报告基因不仅也能作为标记基因，还能用于研究基因的表达调控，检测启动子的活性，发现新的启动子，观察报告基因和目的基因的融合蛋白在细胞内的位置等。在植物基因工程研究领域广泛应用，如荧光素酶基因（luc），不但无放射性，半衰期短，而且检测方法灵敏及简单。将报告基因（荧光酶素基因）与目的基因连接成融合基因，然后构建表达载体，融合基因表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能。

（8）在基因工程中，如何将逆转录病毒作为载体来构建基因表达载体的？

基因工程中常用动植物病毒及λ噬菌体的衍生物作为载体来构建基因表达载体，原因是它们有双链DNA分子，可以与目的基因进行连接。而目前基因工程中常以逆转录病毒作为载体，其优点是逆转录病毒作为载体时可以将外源基因插入到受体细胞染色体，使外源基因随染色体DNA的复制而复制，并进行表达。

研究发现逆转录病毒基因组（RNA）的核心部分包括三个基因：gag基因（编码病毒的核心蛋白）、pol基因（编码逆转录酶）、env基因（编码病毒的表面糖蛋白）。而位于这些基因两端的有LTR序列（含有启动子、调节基因等），控制着逆转录基因组核心基因的表达及转移。

图4是构建逆转录病毒载体及用于培育转基因小鼠的流程图。首先通过逆转录法将病毒的RNA进行逆转形成双链DNA，将其中的gag、pol、env等3个核心基因对应的部分全部切下，并用目的基因替换到相应的部位。然后，将通过以上操作得到的2个DNA分子分别构建基因表达载体并注入到同一个特殊的动物细胞中，2个DNA片段都能在特殊细胞中表达。3个核心基因表达出病毒的外壳蛋白；含有目的基因的DNA片段能转录出含有LTR和目的基因的mRNA的RNA片段，在特殊细胞中逆转录病毒的外壳即可包装该RNA片段，形成新型的逆转录病毒即为构建的逆转病毒表达载体，从而成为一种含有目的基因的具有感染力的逆转录病毒颗粒。

图4 构建逆转录病毒载体及用于培育转基因小鼠的流

这种逆转录病毒载体作为一种表达载体，在侵染了动物细胞后可以通过反转录法形成双链DNA并整合到动物细胞的染色体上，从而可以通过细胞分裂传给下一代的子细胞，并永久性地表达目的蛋白。