酶联免疫检测在冰葡萄组培苗上的应用

王丹萍 曲 淼 杨殿静 赵殿辉 王洪伟

（通化市园艺研究所 吉林通化 134000）

葡萄是果树中感染病毒病最多的树种之一，种类多，分布广，危害大。现发现的葡萄病毒病20个属55种，我国鉴定明确的葡萄病毒总共有6种。北冰红冰葡萄发现有四种主要病毒，葡萄卷叶病毒（GLRaV）、葡萄花叶病（GCMV）、葡萄扇叶病毒（GFLV）、葡萄栓皮病毒（GCBD）。本试验通过酶联免疫检测手段筛选无病毒种苗，进而达到扩繁和工厂化生产北冰红脱毒苗的目的。

1 试验流程

通过人工观察筛选无病毒病表现优良单株（田间鉴定），扦插繁育少量种苗，取茎尖进行无病毒植株接种，将组培苗置入培养箱38℃高温脱毒培养，后进行酶联免疫吸附测定试剂检测病毒。

血清学检测葡萄病毒是目前检测植物病毒的重要技术之一。本试验利用美国NanD.LLC公司针对葡萄四种病毒的酶联免疫吸附测定试剂，采用三抗体夹心法，碱性磷酸酶结合进行酶联免疫吸附（ELTSA）测定。

1.1 试验材料

包被抗体、AP共轭A瓶、AP共轭B瓶、葡萄扇叶病毒（GFLV）正对照、葡萄扇叶病毒（GFLV）负对照、葡萄栓皮病毒（GCBD）正对照、葡萄栓皮病毒（GCBD）负对照、葡萄花叶病毒（GCMV）正对照、葡萄花叶病毒（GCMV）负对照、葡萄卷叶病毒（GLRaV）正对照、葡萄卷叶病毒（GLRaV）负对照、纳米诊断的ELISA测试的冻干对照、PNP底片、PNP板、测试板、培养皿、平底板、移液器、试管、冰箱、培养箱

1.2 制备所有缓冲液

缓冲液配方：①包被缓冲液：碳酸钠1.60g、碳酸氢钠2.92g、叠氮化钠0.2g溶于蒸馏水，定容至1000毫升，pH值调至9.6，4℃贮藏。②PBST缓冲液：二碱基磷酸钠1.15g、磷酸钾0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、吐温-20 0.5g溶于蒸馏水，定容至1000毫升，调节pH值至7.3。……