牧区醪糟分离菌在燕麦醪糟发酵工艺中的应用

刘红微，张美莉

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院 呼和浩特 010018）

燕麦是禾本科燕麦属草本植物，主要有皮燕麦和裸燕麦（莜麦）2 种。燕麦是一种“食疗兼备”的全价营养谷物，可满足人们对膳食“营养与健康”的追求[1]。燕麦有“九粮之尊”的美誉，富含蛋白质、不饱和脂肪酸、矿物质、维生素、酚类化合物及可溶性膳食纤维，丰富的营养成分赋予燕麦良好的营养价值、药用价值、美容价值、食用价值及饲用价值[2-4]。研究表明，燕麦具有调节血脂、内皮细胞功能、血凝和纤维蛋白溶解性，提高机体免疫力，降低胆固醇，调节血糖，改善肠道菌群，降低血压，对抗肥胖、慢性肾脏病、紫外线的功效[5-9]。近年来，因燕麦的保健功能，故其产品开发备受关注，如以燕麦为原料的酒类、发酵乳、甜醅等。以燕麦为原料的食品日益增多，而对燕麦醪糟的研究和生产报道较少。燕麦醪糟在发酵过程中，微生物引发物质的有机转化，可将碳水化合物转化为醇类或有机酸及各种功能成分，赋予燕麦醪糟丰富的营养及功效[10-11]。通过传统食品中发酵微生物的资源开发，筛选性能好、适应性强的优良菌株，将其应用到传统食品的生产中，有利于发酵的顺利进行、物质的转化及功能成分的形成，更好地满足传统食品的发展需求。本研究将内蒙古牧区醪糟中分离得到的菌株接种于燕麦醪糟的发酵过程中，进行菌种筛选试验、单因素实验及正交试验，旨在获得明确的发酵工艺参数，获得品质稳定的产品，为燕麦醪糟的工业化生产提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

燕麦粉、黍米粉均为市售；牧区醪糟分离菌：1#、2#、3#、4#、5#、6#，以上菌株从内蒙古鄂尔多斯地区的牧区醪糟中分离得到；大曲酒酵母、果酒酵母、黄酒酵母购自湖北安琪酵母股份有限公司；马克思克鲁威酵母、球拟酵母、汉逊酵母由内蒙古河套酒业集团股份有限公司技术中心实验室提供；氢氧化钠等试剂均为国产分析纯级，天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

7890A/5975C 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；DB-Wax （30 m×0.25 mm×0.2 μm）毛细管柱，美国Varian 公司；涂层厚度为50/30 μm复合DVB-CAR-pDMS，美国Varian 公司；G6580-CTC 自动进样器，美国Agilent 公司；普及型 pH计，塞多利斯公司。

1.3 工艺与方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 组合菌种的筛选

1.3.2.1 菌种活化 参考邢慧雅[12]和梁敏等[13]的方法进行菌种活化，活化后，加入0.85%的生理盐水制成菌悬液，按10%的接种量于液化液中驯化培养，培养成熟后于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.3.2.2 牧区醪糟分离菌的筛选 由表1可知，6株醪糟分离菌均能够产生蛋白酶和脂酶，可以水解蛋白质和脂类物质，1#、3# 与5# 菌株能够产生淀粉酶，具有水解淀粉的能力；6 株菌在32 ℃至65 ℃均有生长，生长温度幅度较宽，利于进行高温发酵。介于6 株牧区醪糟分离菌的产酶特性及耐温特性，将其以2 种菌、3 种菌、4 种菌、5 种菌、6种菌的方式进行组合，各菌株的比例为1∶1[14]，各组合菌按10%的接种总量接入液化液中，55 ℃发酵72 h，测定总酸、pH 值并进行感官评分，确定最佳醪糟分离菌的组合。1#菌与2#菌的组合以12#表示，其余组合以此类推。

表1 6 株菌的特性Table 1 Characteristics of 6 different bacteria

1.3.2.3 酵母菌的筛选

1）产酒酵母的筛选 基于杨蕾[15]研究的基础，用产酒酵母代替传统工艺中加入的10%高度白酒，进行产酒酵母筛选试验。将驯化培养的大曲酒酵母、黄酒酵母、果酒酵母分别按3%的接种量接入液化液中，30 ℃发酵72 h，测定酒精度、还原糖含量并进行感官评分，确定最佳产酒酵母。

2）产香酵母的筛选 为了使产品香气更加丰裕，进行产香酵母的筛选试验。将驯化培养的球拟酵母、汉逊酵母、马克思克鲁威酵母分别按3%的接种量接入液化液中，30 ℃发酵72 h，测定酒精度、还原糖含量并进行感官评分，确定最佳产香酵母。

3）产酒酵母、产香酵母使用比例的筛选[16]产酒酵母、产香酵母按1∶2，1∶4，2∶1，3∶1 的比例，按接种总量3%的接种量接入液化液中，30 ℃发酵72 h，测定酒精度、还原糖含量并进行感官评分，确定酵母菌最佳使用比例。

1.3.2.4 酵母菌与牧区醪糟分离菌的比例筛选 酵母与分离菌按1∶3，1∶4，1∶5 比例，按接种总量15%接入液化液中，30 ℃发酵24 h 后，55 ℃发酵至72 h，测定酒精度、pH 值、总酸并进行感官评分，筛选出酵母菌与醪糟分离菌的最佳比例[17-18]。

1.3.3 发酵工艺

1.3.3.1 单因素实验

1）接种量对燕麦醪糟的影响 复合发酵菌按5%，10%，15%的接种量接入到液化液中，30 ℃发酵24 h 后，55 ℃继续发酵至72 h，发酵结束后测定还原糖、总酸、pH 值并进行感官评分，确定最佳接种量。

2）发酵温度对燕麦醪糟的影响 复合发酵菌按15%的接种量接入到液化液中，30 ℃发酵24 h 后，分别在40，45，50，55 ℃下继续发酵至72 h，发酵结束后测定还原糖、总酸、pH 值并进行感官评分，确定最佳发酵温度。

3）发酵时间对燕麦醪糟的影响 复合发酵菌按15%的接种量接入到液化液中，30 ℃发酵24 h 后，55 ℃继续发酵至48，60，72，84 h，测定还原糖、总酸、pH 值并进行感官评分，确定最佳发酵时间。

1.3.3.2 正交试验优化 在单因素实验的基础上，以复合发酵菌接种量（B）、发酵时间（C）、发酵温度（A）为因素，以感官评分、糖酸比、总酸含量为指标，进行三因素三水平正交试验，确定最佳发酵工艺。

1.4 检测方法

1）pH 值的测定 用pH 计进行pH 值测定。

2）酒精度的测定 参照GB/T 13662-2008《黄酒》，采用蒸馏比重法测定酒精度。

3）总酸含量的测定 参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》的酸碱滴定法，测定总酸含量。

4）感官评分表 参照杨蕾[15]和何勇[19]的研究，以燕麦醪糟的形态与色泽、香味、口感指标对燕麦醪糟进行评价，满分以10 分计，评分标准见表2。

表2 燕麦醪糟感官评分表Table 2 Sensory evaluation standard of oat Laozao

1.5 数据统计分析

采用Excel 对数据进行整理并作图及用SPSS 25.0 分析软件进行正交设计及数据分析。

2 结果与分析

2.1 牧区醪糟分离菌筛选结果

2.1.1 2 种组合菌筛选结果 2 种组合菌发酵试验结果表明，接种13# 组合菌、15# 组合菌、35# 组合菌、45# 组合菌的燕麦醪糟感官评分高于7 分，总酸含量相对较低，各组间pH 值无明显差异；2种组合菌发酵制得的醪糟整体感官评分低，后续试验不做选择。

2.1.2 3 种组合菌筛选结果 由表3可知，接种245# 组合菌的燕麦醪糟感官评分高达9.13 分，显著高于其余12 组，达到一级水平；接种235# 组合菌、346# 组合菌的燕麦醪糟感官评分达到二级水平显著高于其余10 组；接种245# 组合菌、235#组合菌、346# 组合菌的燕麦醪糟总酸与pH 值较低。选245# 组合菌、235# 组合菌、346# 组合菌进行后续试验。

表3 3 菌种组合对燕麦醪糟的影响Table 3 Effect of three bacteria on oat Laozao quality

2.1.3 4 种组合菌的筛选结果 表4显示，接种2345# 组合菌的燕麦醪糟感官评分达一级水平，显著高于其余各组；接种2345# 组合菌、3456# 组合菌的燕麦醪糟总酸含量及pH 相对较低；选2345#组合菌、3456#组合菌进行后续试验。

表4 4 菌种组合对燕麦醪糟影响Table 4 Effect of four bacteria on oat Laozao quality

2.1.4 5，6 种组合菌的筛选结果 表5可知，接种5，6 种菌种组合的燕麦醪糟整体感官评分高，接种23456# 组合菌、123456# 组合菌的燕麦醪糟感官评分显著高于其余3 组，总酸、pH 值显著低于其余3 组，选23456# 组合菌、123456# 组合菌进行后续试验。

表5 5，6 菌种组合对燕麦醪糟影响Table 5 Effect of five and six bacteria on oat Laozao quality

2.1.5 醪糟分离菌的筛选结果 醪糟分离菌各组合试验为不同批次完成，无法进行统一比较，所以将245# 组合菌、235# 组合菌、2345# 组合菌、3456# 组合菌、23456# 组合菌 及123456# 组合菌选出进行同一批次试验，确定最佳分离菌的使用。

由表6可知，除235# 组合菌外，其余5 组燕麦醪糟的感官评分均高于9 分，达到一级水平；245# 组合菌燕麦醪糟的感官评分最高，且总酸最低，产品酸甜适口，所以燕麦醪糟分离菌选定为2#、4#与5#，三者间的比例为1∶1∶1。

表6 不同组合菌种对燕麦醪糟的影响Table 6 Effect of different microbial combinations on oat Laozao quality

2.2 酵母菌的筛选结果

2.2.1 产酒酵母的筛选结果 由表7可知，接种果酒酵母的燕麦醪糟的感官评分、还原糖含量显著高于大曲酒酵母、黄酒酵母，产品酒香清淡，有淡淡甜香，故产酒酵母选果酒酵母。

表7 产酒酵母对燕麦醪糟的影响Table 7 Effect of alcohol-producing yeast on oat Laozao

2.2.2 产香酵母的筛选结果 由表8可知，接种3种产香酵母的燕麦醪糟的还原糖含量、酒度无明显差异；接种马克思克鲁威酵母的燕麦醪糟感官评分高于球拟酵母与汉逊酵母，所以产香酵母菌选马克思克鲁威酵母。

表8 产香酵母对燕麦醪糟的影响Table 8 Effect of aroma-producing yeast on oat Laozao

2.2.3 产酒酵母与产香酵母使用比例的筛选结果 由表9可知，产酒酵母与产香酵母的比例为3∶1时，燕麦醪糟的感官评分、酒度显著高于其余组，还原糖含量低于其余组，此比例下的燕麦醪糟酒香与粮香兼备，酸甜适口。因此，产酒酵母与产香酵母的比例选定为3∶1。

表9 复合酵母菌对燕麦醪糟的影响Table 9 Effect of complex yeast on oat Laozao

2.3 酵母菌与牧区醪糟分离菌比例的筛选结果

由表10可知，酵母菌与分离菌比例为1∶3时，燕麦醪糟的感官评分与糖酸比显著高于其余组，总酸低于其余组，酒度与还原糖各组间无明显差异。此比例下制得的燕麦醪糟，酸甜适口，入口绵和，故酵母菌与牧区醪糟分离菌的最佳比例为1∶3。

表10 复合发酵菌对燕麦醪糟的影响Table 10 Effect of combined fermentation microbes on oat Laozao

2.4 燕麦醪糟发酵工艺的确定

2.4.1 单因素实验结果与分析

2.4.1.1 接种量对燕麦醪糟的影响 图1a 和1b显示，燕麦醪糟的感官评分随接种量的增加先升高后降低，糖酸比随接种量的增加呈下降趋势，总酸含量随接种量的增加呈上升趋势。接种量5%时，糖酸比过高，产品甜腻；接种量15%时，糖酸比低，产品偏酸；接种量10%时，燕麦醪糟感官评分最高，酸甜适口，入口绵和。由此可见，接种量10%为最佳接种量。

图1 接种量对感官评分、总酸及糖酸比的影响Fig.1 Effect of inoculation amount on sensory score，total acid and sugar acid ratio

2.4.1.2 发酵温度对燕麦醪糟的影响 图2a 和2b示，燕麦醪糟的感官评分、糖酸比随发酵温度的升高先升高后降低，总酸含量随发酵温度的升高呈下降趋势。发酵温度50 ℃，产品的感官评分、糖酸比最高、酸甜适口，故发酵温度选为50 ℃。

图2 发酵温度对感官评分、总酸及糖酸比的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on sensory score，total acid and sugar acid ratio

2.4.1.3 发酵时间对燕麦醪糟的影响 由图3a和3b 可知，燕麦醪糟的感官评分、糖酸比和总酸含量随着培养时间的增长先升高后降低。当发酵60 h 时，燕麦醪糟的感官评分、糖酸比最高，总酸最低，有酒香、发酵香，所以发酵时间选为60 h。

图3 发酵时间对感官评分、总酸及糖酸比的影响Fig.3 Effect of fermentation time on sensory score，total acid and sugar acid ratio

2.4.2 正交试验的结果与分析 由表11可知，影响燕麦醪糟感官品质的主次因素为A＞B＞C，发酵温度对燕麦醪糟有很大影响，是主要控制因素，其次是接种量，最优组合是A2B2C3，即燕麦醪糟最佳发酵工艺为发酵温度50 ℃，接种量10%，发酵时间72 h。

表11 正交试验设计和结果Table 11 Results of fermentation orthogonal test

由于最优组合A2B2C3不在表11的9 组试验中，因此，为保证试验稳定性，将最优工艺A2B2C3进行3 次重复试验，3 次重复试验燕麦醪糟的感官评分为9.3，9.1，8.9，最终感官评分均值9.1 分，达到一级水平。

3 结论

本研究以燕麦-黍米复合粉为原料，首次使用牧区醪糟分离菌，且将其与酵母菌结合，共酵研制燕麦醪糟。研究得如下结论：1）牧区醪糟分离菌组合为2#、4#、5#，三者之间的比例为1∶1∶1；产酒酵母菌为果酒酵母，产香酵母为马克思克鲁威酵母，二者之间的比例为3∶1；复合发酵菌由酵母菌与醪糟分离菌组成，酵母菌与分离菌的比例为1∶3。2）发酵时间、发酵温度与接种量对燕麦醪糟的感官、总酸含量及糖酸比均有影响；影响燕麦醪糟感官评分各因素中，其作用大小依次为发酵温度＞接种量＞发酵时间。3）最佳发酵工艺为：接种量10%，30 ℃发酵24 h 后，50 ℃继续发酵48 h，共发酵72 h。在该条件下燕麦醪糟呈淡黄色，有淡淡的酒香、粮香、酯香且酸甜适口。