葵花籽油微乳液对万寿菊中叶黄素提取工艺优化

吴红艳，安琪，李秀鑫，郎秀杰，吕美艳

(齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

万寿菊中含有大量的天然色素，随着人们对食品营养的关注度日益提升，人工合成色素被天然色素取代逐渐成为一种趋势[1]，且万寿菊具有祛风降火、化痰止咳、平肝清热的功效[2]，其主要酚类包括原儿茶素、绿原酸、没食子酸和阿魏酸[3]。万寿菊花具有药用价值，且可加工提取色素等，具有较好的经济价值，其叶黄素含量非常高，类胡萝卜色素的含量非常低，是提取叶黄素的理想材料[4]。万寿菊富含的天然叶黄素是生物中的天然色素，它能延缓老年人因黄斑退化而引起的视力退化和失明症与由于身体老化导致的心血管硬化、冠状动脉硬化、肿瘤疾病[5-6]。

微乳液通常是由表面活性剂，表面活性剂、水和油组成的光学各向同性的热力学稳定系统[7]。微乳的粒子直径在1～100 nm[8]，其粒子较小、比表面积大，具有十分高的界面积/体积比，表面活性剂使微乳粒子形成界面膜，具有较大接触面积[9]，对脂溶性的有机物和水溶性的极性物质有较好的溶解性能，具有同时增强对水难溶物和油难溶物的能力[10]。微乳对物质的提取，不仅有迅速、效率高的特点，而且能解决和排除乳状液的不稳定、易溶胀、破乳难等缺点[11]。Rao等[12]采用O/W型微乳从胡萝卜果渣中提取β-胡萝卜素，提取效率高、毒性小，为微乳液在食品运载功能因子的研究奠定了基础。

Reineccius G[13]将香精、增香剂与乳化剂相结合来制备微乳液，以提高香精的稳定性。微乳液也可以作为提取花椒、大料中风味物质的载体[14]。田一农[15]利用微乳液来抑制茶饮料沉淀效果突出，能较好地保留茶饮料中的风味物质和营养成分，可以说明微乳液在风味物质储藏和释放过程中发挥着重要作用。目前工业上普遍采用有机溶剂提取万寿菊中叶黄素[16]，但有机溶剂存在毒性大、污染严重和价格昂贵等问题[17]。从微乳中提取，不仅可以提取脂溶性色素，还可以提取水溶性色素，发挥成分间的协同作用，提取更完美，提取效率更高[18]，同时可以克服有机溶剂提取的危害和能量消耗，降低费用，提高叶黄素的生物利用率[19]。

1 材料与方法

1.1 材料

多力葵花籽油：上海佳格食品有限公司；万寿菊颗粒：广州立达尔生物科技股份有限公司；叶黄素标准品：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 试剂

吐温80、司班80：天津市光复精细化工研究所；万寿菊颗粒：广州立达尔生物科技股份有限公司；超纯水。

1.3 主要仪器与设备

EMS-8B恒温磁力搅拌器 天津欧诺仪器有限公司；SHZ-C水浴恒温振荡器 上海跃进医疗器械厂；DL-360E智能超声波清洗器 上海之信仪器有限公司；海尔微波炉 青岛海尔微波炉有限公司；SHD-D循环水式真空泵 巩义市英裕予华设备厂；722S型可见光谱光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 葵花籽油微乳液的制备

将司班80和吐温80按质量比为1∶10的比例置于磁力搅拌器(25 ℃)进行混合，再将其与葵花籽油按照质量比为7∶1均匀混合，然后向其中逐滴加入超纯水，从而可得到水包油型葵花籽油微乳液。

1.4.2 万寿菊颗粒中叶黄素含量的测定

1.4.2.1 微乳液-叶黄素的标准曲线

准确称取10.00 mg叶黄素，将其配制成0.10 mg/mL的叶黄素-微乳液标准溶液，对照组为等浓度梯度溶液的葵花籽油微乳液，进行比较，标准曲线方程为y=112.85x+0.1735，R2=0.9985。

1.4.2.2 万寿菊颗粒中叶黄素的提取

称取1.00 g万寿菊颗粒，按照一定比例将其与微乳进行均匀混合，利用水浴法提取一定时间，然后进行抽滤处理，随即进行吸光度值的测定。根据标准曲线方程计算出万寿菊中叶黄素的含量并根据公式计算出提取率：

式中：E为叶黄素的提取率，%；ρ为叶黄素的含量，mg/mL；V为提取剂的体积，mL；m为万寿菊颗粒的质量，g；n为稀释倍数。

1.4.3 提取叶黄素的单因素试验

1.4.3.1 固液比对叶黄素提取的影响

将5份万寿菊颗粒各1.00 g且不同固液比的样品置于40 ℃水浴振荡器中，水浴加热90 min进行抽滤，定容后在447 nm处测吸光度值，计算叶黄素提取率。

1.4.3.2 温度对叶黄素提取的影响

将固液比为1∶90(g/mL)的样品分别在不同温度下水浴振荡，随后将其水浴加热90 min后进行抽滤定容，在447 nm处测吸光度值，计算叶黄素提取率。

1.4.3.3 时间对叶黄素提取的影响

将固液比为1∶90的样品置于40 ℃水浴振荡器中，分别在不同时间下加热后进行抽滤定容，在447 nm处测量其吸光度值，计算叶黄素提取率。

1.4.4 微乳提取叶黄素的响应面分析试验

通过单因素试验计算万寿菊颗粒中叶黄素的提取率，并进行响应面优化分析法设计的试验方案，见表1。

表1 响应面试验因素及水平表Table 1 The factors and levels of response surface test

1.4.5 数据分析

每个试验重复3次，显著性用IBM SPSS Statistics 19.0软件进行分析，数据用Origin 8.0软件进行处理，并绘制图形。

2 结果与分析

2.1 固液比对万寿菊中叶黄素提取率的影响

由图1可知，当固液比为1∶60 (g/mL)时，叶黄素的提取率最大。微乳液的量越多可使万寿菊与微乳液的接触面积越大，反应得更加充分，因此越有利于叶黄素的提取。但是当溶剂用量过多时，不但叶黄素的提取率会减少，而且增加反应成本[20]，在固液比为1∶60 (g/mL)后，叶黄素提取率下降，可能是由于固液比增大，非有效成分提取量大[21]，从而导致叶黄素提取率下降，所以本试验通过综合考虑选择提取叶黄素的最佳固液比为1∶60 (g/mL)。

图1 不同固液比万寿菊中叶黄素提取率Fig.1 The extraction rates of lutein in marigold with different solid-liquid ratios

2.2 温度对万寿菊中叶黄素提取率的影响

由图2可知，在30～40 ℃之间时，随着加热温度的增加，叶黄素的提取率也增加，说明温度越高其分子越活跃，叶黄素的溶解越好，体系的温度会影响叶黄素微粒在微乳中的运动特性以及分子的扩散速度[22]，但是当温度超过40 ℃时，提取率出现下降，可能是由于温度越高，叶黄素分子间的结构遭到破坏，叶黄素不能更好地反应，因此提取率开始下降，当温度达到50 ℃时，提取率又开始升高，是因为微乳液开始破乳，溶液变浑浊，影响叶黄素的提取率，同时过高的温度也会对生产过程增加复杂性和过多的能量消耗[23]。因此，选取提取叶黄素的最佳温度为40 ℃。

图2 不同温度万寿菊中叶黄素提取率Fig.2 The extraction rates of lutein from marigold at different temperatures

2.3 提取时间对万寿菊中叶黄素提取率的影响

由图3可知，当提取时间为90 min时，叶黄素的提取率达到最大值。提取时间为30～90 min时，叶黄素与微乳之间有着相对较大的色素浓度差值。在固液比恒定的条件下，色素要扩散到微乳液中所需时间较短，不能使色素充分地扩散到微乳中[24]，因此提取率较低。时间超过90 min后叶黄素的提取率开始下降，因为时间过长可能会破坏叶黄素的稳定性。因此，选取90 min为最佳的提取时间。

图3 不同提取时间万寿菊中叶黄素提取率Fig.3 The extraction rates of lutein in marigold at different time

2.4 响应面优化试验结果分析

根据表1的设计方案利用Design-Expert软件进行响应面分析试验，设计了17组试验数据来确定微乳提取万寿菊中叶黄素的最佳工艺条件，试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface test design and results

2.4.1 模型建立及分析评价

将表2的试验数据进行多元回归拟合，二次多项回归模型为：

R1=0.086-0.0004375A+0.002088B+0.0008500C-0.002500AB+0.001625AC-0.0006750BC-0.005580A2-0.005230B2-0.006405C2。

回归模型系数的检验结果见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression model

续 表

由表3可知，模型大于F值的概率为0.0005，说明测试中采用的模型对响应值Y有显著影响，在该模型中B对响应值Y的影响显著，AB对模型相互作用的响应值Y的影响显著。在模型的二阶项中，A2、B2、C2对响应值Y的影响非常显著;模型的失拟项P为0.1337，不显著，说明此模型与实际有着良好的拟合性，线性关系显著。该方法可用于分析和预测葵花籽油微乳液从万寿菊颗粒中提取叶黄素的工艺。

2.4.2 响应曲面图谱分析

为了进一步研究相关因素的交互作用，并确定最优点，对回归模型进行响应曲面图谱分析，见图4～图6。

由图4～图6可知，4个响应因素在相对应的试验范围内都有响应极值，且3组因素的交互作用结果与方差分析结果一致。

图4 因素A和B交互作用的响应面及等高线图Fig.4 Response surface and contour map of interaction between factor A and factor B

图5 因素A和C交互作用的响应面及等高线图Fig.5 Response surface and contour map of interaction between factor A and factor C

图6 因素B和C交互作用的响应面及等高线图Fig.6 Response surface and contour map of interaction between factor B and factor C

2.4.3 响应面验证试验

根据Design-Expert软件优化出的最佳万寿菊颗粒中叶黄素的提取条件是：温度39.60 ℃、时间96.46 min、固液比1∶60.67(g/mL)。在此条件下，叶黄素的提取率理论值为0.86%。通过3次平行验证试验，在最佳提取条件下的实际提取率为0.0860%，接近预测的理论值。此模型可以更好地反映出各种因素对叶黄素提取率的影响。

3 结论

本研究利用葵花籽油微乳提取万寿菊中的叶黄素。固液比、温度、时间3个因素对葵花籽油微乳提取万寿菊颗粒中叶黄素均有影响，其主次顺序是时间>固液比>温度。时间对万寿菊颗粒中叶黄素提取率的影响显著，温度对万寿菊颗粒中叶黄素提取率的影响不显著，该模型与实际相符，具有显著的线性关系。最佳万寿菊颗粒中叶黄素的提取条件为固液比1∶61(g/mL)、温度40.00 ℃、时间96 min，此时叶黄素的实际提取率为0.86%。用葵花籽油微乳萃取技术提取万寿菊中叶黄素可以避免有机溶剂污染大、有毒性等缺点，该试验可以为提取叶黄素的研究提供可靠的科学基础。使用微乳液对风味物质进行包埋，开发新的可控释技术，对于开发新产品、延长产品货架期、改善感官品质都有重要意义。