严重烧伤患者外周血中性粒细胞趋化功能的变化及影响因素

蒋 逸，施文娟，徐琦量，周 剑，王惠康，戴 强，偰时欢

（溧阳市人民医院烧伤整形科，江苏 溧阳 213300）

感染是烧伤患者常见的严重并发症之一。感染是导致烧伤患者发生多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）、全 身 炎 症 反 应 综 合 征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)、脓毒症休克及死亡的主要危险因素[1]。有研究表明，感染可使烧伤患者出现体内环境稳态失衡的现象，致使其发生多器官衰竭、组织损伤等并发症，严重时可导致其死亡[2]。严重烧伤患者的病情复杂且病程较长，其感染症状若未能得到有效的控制，可诱发MODS、SIRS、脓毒症休克、烧伤脓毒症等病症[3-4]。中性粒细胞（neutrophil，NEU）是机体免疫机制的第一道防线，其免疫应答作用在严重烧伤患者抵御感染中起着关键的作用[5]。本次研究主要是探讨严重烧伤患者伤后早期其外周血NEU趋化功能的变化及影响因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究的对象为2019年5月至2021年1月期间溧阳市人民医院收治的14例严重烧伤患者和同期在该院接受健康体检的14例体检者。将14例严重烧伤患者作为研究组，将接受健康体检的14例体检者作为参照组。在研究组患者中，有男性8例，女性6例；其平均年龄为（36.2±10.5）岁。在参照组体检者中，有男性10例，女性4例；其平均年龄为（35.9±10.2）岁。两组研究对象的一般资料相比，P＞0.05，具有可比性。

1.2 研究方法

对两组研究对象均进行外周血NEU、C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降 钙 素 原（procalctionin，PCT）、中性粒细胞计数（neutrophil count，NEUT）、血小板计数（platelet count，PLT）、白细胞计数（white blood cell count，WBC）、肿 瘤 坏 死 因 子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白 介 素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-10（interleukin-10，IL-10）检测。然后，对两组研究对象的检测结果进行分析研究，总结严重烧伤患者伤后早期其NEU趋化功能变化的情况及影响因素。对研究对象进行外周血NEU、CRP、PCT、NEUT、PLT、WBC、TNF-α、IL-6和IL-10检测的方法是：1）在研究组患者入院后的第1 d、第3 d和第5 d及参照组体检者接受体检的当天，使用4个2 mL的采血管采集其外周静脉血作为检测标本。2）对研究对象进行外周血NEU检测。⑴使用Ficoll密度梯度离心法分离研究对象的NEU。分别取研究组患者入院后第1 d、第3 d和第5 d及参照组体检者的检测标本，按照1:1的比例向检测标本中加入30 g/L的右旋糖酐，将检测标本在室温条件下静置20 min后，提取上清液。对上清液进行离心处理（时间为10 min，重力加速度为400×g，温度为15℃）后，加入3 mL 的Hank平衡盐溶液（不含钙离子和镁离子），再次对其进行悬浮、沉淀处理。避光吸取3 mL的Ficoll淋巴细胞分离液后继续进行离心处理（时间为0.5 h，重力加速度为400×g，温度为20℃），除去上清液后使用裂解液对沉淀物中的红细胞进行裂解，再次对经裂解的红细胞进行离心处理（时间为0.5 h，重力加速度为400×g，温度为20℃）。重复进行2次的红细胞裂解，除去上清液后即获得浓度为5×106个/mL 的NEU。⑵使用琼脂糖趋化试验法检测外周血NEU的趋化距离。①在RPMI 1640培养基（含有4.6 mL的热灭活胎牛血清）中加入0.55 g的琼脂糖，再将其与Hank平衡盐溶液混合并轻微震荡后配制成混合液。②将配制好的混合液静置在温度为70℃的热水箱中进行20 s的水浴，然后将其放在无包被的培养皿（直径为35 mm）中，在室温条件下让其冷却凝固。③在空心管（孔径为3.5 mm）上打3个孔（间距为2.4 mm）。④将从研究组患者检测标本中分离出的NEU的细胞浓度调整为1×107个/mL，分别将10 μL的NEU加入空心管两边的孔内，再将同体积的1L趋化物IL-8加入到空心管中间的孔内。⑤将空心管置于含有5%CO2的培养箱中（温度为37℃）进行2 h的培养，然后在显微镜（倒置，40倍）下观察NEU的趋化距离。⑥分别取研究组患者入院后第3 d和参照组体检者接受体检当天的外周血NEU进行离心处理（时间为10 min，400×g，温度为4℃），然后对经离心处理后的细胞重新使用预冷项目缓冲存储器（program buffer storage，PBS）进行3次悬浮处理，去除上清液，再次使用结合缓冲液（100 μL）对细胞进行悬浮处理。将适量的鼠抗人CXCR、CXCR2流式抗体（分别经藻红/藻蓝蛋白标记）加入经处理后的细胞中，孵育0.5 h。对孵育后的细胞进行离心处理，去除上清液，再次使用500 μL的结合缓冲液对其进行悬浮处理，最后使用流式细胞仪检测外周血NEU中CXCR1、CXCR2等趋化因子受体的表达情况。3）分别取研究组患者入院后第1 d、第3 d和第5 d及参照组体检者的检测标本进行CRP、PCT、NEUT、PLT、WBC检测。4）分别取研究组患者入院后第1 d、第3 d和第5 d及参照组体检者的检测标本，在室温条件下静置0.5 h后对其进行离心处理（时间为10 min，重力加速度为400×g），提取血清。使用酶联免疫吸附测定法检测血清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量，严格按照试剂盒的说明书进行操作。

1.3 统计学分析

对本次研究中的数据均采用SPSS 22.0统计软件进行处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，采用χ²检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象外周血NEU趋化距离的比较

研究组患者入院后第1 d、第3 d和第5 d其外周血NEU的趋化距离均短于参照组体检者，P＜0.05。详见表1。

表1 两组研究对象外周血NEU趋化距离的比较（μm，±s）

表1 两组研究对象外周血NEU趋化距离的比较（μm，±s）

注：*与参照组相比，P＜0.05。

组别 外周血NEU的平均趋化距离研究组（n=14）入院后第1 d 1478±103*入院后第3 d 1394±83*入院后第5 d 1016±92*参照组（n=14） 1901±121

2.2 两组研究对象外周血NEU中趋化因子受体CXCR1和CXCR2阳性表达率的比较

研究组患者外周血NEU中趋化因子受体CXCR1和CXCR2的阳性表达率均低于参照组体检者，P＜0.05。详见表2。

表2 两组研究对象外周血NEU中趋化因子受体CXCR1和CXCR2阳性表达率的比较（%，±s）

表2 两组研究对象外周血NEU中趋化因子受体CXCR1和CXCR2阳性表达率的比较（%，±s）

注：*与参照组相比，P＜0.05。

组别 CXCR1的阳性表达率 CXCR2的阳性表达率研究组（n=14） 48.2±1.7* 79.1±1.7*参照组（n=14） 95.5±4.4 97.7±2.2

2.3 两组研究对象外周血CRP、PCT、WBC、NEUT和PLT水平的比较

研究组患者入院后第1 d、第3 d和第5 d其外周血CRP、PCT、WBC和NEUT的水平均高于参照组体检者，其外周血PLT的水平与参照组体检者相比，P＞0.05。详见表3。

表3 两组研究对象外周血CRP、PCT、WBC、NEUT和PLT水平的比较（±s）

表3 两组研究对象外周血CRP、PCT、WBC、NEUT和PLT水平的比较（±s）

注：*与参照组相比，P＜0.05。

组别 CRP的平均水平（mg/mL）PCT的平均水平（ng/mL）WBC的平均水平（×109/L）NEUT的平均水平（×109/L）PLT的平均水平（×109/L）研究组（n=14）入院后第1 d 79.2±1.4* 4.6±2.2* 13.5±3.9* 7.8±0.03* 187±92入院后第3 d 96.4±0.5* 5.9±2.4* 13.2±2.7* 9.6±0.01* 194±93入院后第5 d 89.5±0.1* 6.1±1.2* 14.1±3.4* 11.2±0.54* 213±83参照组（n=14）5.1±2.5 0.4±0.1 6.5±2.2 1.8±0.05 218±95

2.4 两组研究对象外周血各项炎性细胞因子水平的比较

研究组患者入院后第1 d、第3 d和第5 d其外周血TNF-α、IL-6和IL-10的水平均高于参照组体检者，P＜0.05。详见表4。

表4 两组研究对象外周血各项炎性细胞因子水平的比较（pg/mL，±s）

表4 两组研究对象外周血各项炎性细胞因子水平的比较（pg/mL，±s）

注：*与参照组相比，P＜0.05。

组别 TNF-α的平均水平IL-6的平均水平IL-10的平均水平研究组（n=14）入院后第1 d 7.5±3.1* 12.1±1.1* 181.2±2.2*入院后第3 d 9.6±3.0* 11.7±2.2* 156.4±1.2*入院后第5 d 10.7±1.5* 9.6±3.1* 233.8±2.9*参照组（n=14）1.1±0.2 2.4±0.5 2.4±1.3

3 讨论

感染是导致烧伤患者死亡或发生脓毒症的重要原因。人体外周血白细胞中NEU的含量最为丰富，约占白细胞总含量的50%～70%。NEU具有黏附、脱颗粒、趋化、活化、吞噬等一系列复杂的生理学功能，是人体内重要的免疫细胞[6]。NEU可起到抗感染的作用[7]。NEU的趋化是指NEU向感染部位做定向运动的过程。NEU的趋化功能出现障碍，可致使机体无法有效地抵抗病原菌，进而可引起MODS[8]。有研究表明，烧伤患者发生死亡与其外周血NEU的迁移失败密切相关[9]。本次研究的结果证实，严重烧伤患者伤后早期其外周血NEU的趋化功能会出现一定程度的障碍，此情况的发生与其外周血NEU中CXCR1、CXCR2等趋化因子受体的阳性表达及其外周血CRP、PCT、WBC、NEUT、TNF-α、IL-6和IL-10水平的升高有关。