生姜蛋白酶基因的克隆及在原核细胞中的表达

卢瑛

摘 要：提取莱芜生姜总RNA，采用RT-PCR技术扩增出生姜蛋白酶（Ginger protease）基因GP2和GP3，经序列比对，发现莱芜生姜蛋白酶基因GP2在945位的碱基与Gene bank中生姜蛋白酶的序列GP2b（GI：57118006）有差異，GP3在451、700和804这3个位置的碱基与GP3b（GI：57118011）有差异，在翻译后的氨基酸也不同，表明了不同生姜品种生姜蛋白酶基因的多样性。将克隆的GP2片段GPII重组到带有His-tag的原核表达载体pET30a（+）中，构建重组表达载体pET-GPII。将重组pET-GPII转化到大肠杆菌BL21（DE3）中构建工程菌株，工程菌株用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，在诱导6 h，IPTG浓度为0.1 mmol/L时，重组GPII表达量最高。SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明蛋白大小约为21 kDa。该实验结果表明生姜蛋白酶能够在原核表达系统进行大量表达，为生姜蛋白酶工程化生产奠定了基础。

关键词：莱芜生姜;生姜蛋白酶;克隆;原核细胞;表达

生姜蛋白酶（Ginger protease/Zingibain，EC 3.4.22.67）是存在于生姜块状根茎中的一种巯基蛋白酶，有两种GP-I和GP-II（GPI和GPII分别与GenBank中GP3和GP2同源性较高），均含有221个氨基酸，含有6个Cys形成3个二硫键为糖蛋白，具有蛋白水解活性。生姜蛋白酶能够水解胶原蛋白，可用于肉类嫩化、酒类澄清，乳制品凝固等[1]，以姜汁为添加剂开发的具有新型保健功能的凝固型酸奶，在广东地区颇受欢迎，因此该酶具有良好的工业化应用前景[2]。

生姜蛋白酶的分离纯化工艺操作复杂，而且生姜蛋白酶的含量在不同生姜品种、不同栽培地区及不同气候条件下差异非常大，甚至同一品种的干姜与生姜之间的含量也不相同，导致生姜蛋白酶的提取率不稳定[3]。尤其生姜常年连作导致茎腐病、斑点病和姜瘟病高发，推升了市场上生姜的价格，使得提取生姜蛋白酶的成本升高，进一步限制了生姜蛋白酶的开发利用。……