外源蛋白在CHO细胞染色体上一个新位点的定点整合和稳定表达

胡湾湾，丁学峰，蔡燕飞，陈 蕴，段作营，金 坚，李华钟*

（1江南大学生物工程学院，无锡214122；2江南大学药学院，无锡214122）

中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞是当前生物制药领域广泛使用的宿主细胞，生产了超过70%的治疗性蛋白质［1-2］。构建CHO工程细胞的传统方法是将外源基因随机整合至细胞基因组内，经过多轮筛选获得重组细胞系。此方法耗时费力，并且重组CHO细胞在生产过程中易丢失目的基因，导致非生产性细胞克隆逐渐增多，不利于生产及监管［3］。寻找稳定的整合位点，将外源基因定点整合至CHO细胞基因组的稳定位点，可有效缩短工程细胞株的构建周期并解决表达不稳定问题［4］。

初始位点的选择对后期的稳定表达起着决定性作用，经过多年的研究发现了一些潜在热点，如人纤维肉瘤细胞HT1080中14号染色体上的Ighg2基因、21号染色体上Gr ik1基因中第12个外显子—第13个内含子区域［5］；CHO-S和HEK293T细胞的Hi pp11基因［6］等。虽然有许多关于稳定位点的研究，但是目前CHO细胞还未有稳定性高、产量理想的整合位点成功应用于工业生产［6］。因此，CHO细胞基因组稳定位点的寻找发现，并探索构建定点整合的稳定高产细胞株，对生物药的研发生产有着重大意义。

本研究团队前期敲除了Bcl-2家族中促凋亡Bak和Bax基因获得了抗凋亡特性明显提升的Bak-/Bax-CHO-K1细胞株（Ie3），应用慢病毒转染和染色体步移技术，发现了该细胞基因组内可表达示踪基因Zs green1的多个位点［7］。其中一个位点位于染色体NW_003614241.1上，在LOC103162683基因和Cob l l1基因之间，富含AT碱基。Cob ll1基因编码蛋白质cordon-bleu WH2 repeat protein like 1，主要与人慢性淋巴细胞白血病和形成胰岛素抵抗相关［8-11］，而在CHO细胞中的功能尚不明确。……