5种生物农药对茶轮斑病病原的室内毒力强度

饶家瑞， 张 欣， 余用秀

(1.贵州省农业科学院 茶叶研究所， 贵州 贵阳 550006； 2.贵州省农业科学院 生物技术研究所， 贵州 贵阳 550006)

茶轮斑病是茶树最严重的病害之一[1]，其主要危害成叶和老叶。目前，茶轮斑病的田间防治仍然以化学农药为主，但其农药残留造成的毒素积累和代谢慢等问题已成为制约茶产业绿色健康发展的关键。近年来，生物农药因其可降解和低毒的特点，已成为茶园田间绿色防控茶轮斑病的新选择[2]。有研究表明，0.5%香菇多糖对茶轮斑病菌具有较好的抑制活性，其EC50为2.68 μg/mL[3]；宁南霉素对茶假拟盘多毛孢菌菌株的EC50为75.92 U/μL[4]；诺沃霉素A在离体条件下对拟盘多毛孢(Pestalotiopsistheae)的EC50为2.11 μg/mL，在75 μg/mL和150 μg/mL浓度下对感染茶轮斑病离体叶片的防治效果分别为68.29%和100%[2]；申嗪霉素对茶轮斑病的EC50为11.23 μg/mL[5]；6%春雷霉素、枯草芽孢杆菌(100亿芽孢/g)和戊唑醇430 g/L对茶轮斑病菌丝的抑制率分别为43.88%、14.29%和44.61%，对孢子萌发的抑制率分别为1.38%、46.17%和100%[6]。引起茶轮斑病的菌属较多，茶拟盘多毛孢(P.theae)、山茶拟盘多毛孢(P.camelliae)等16种菌属均可引起茶轮斑病[7-8]，用药难度较大，防控也因地区不同、病菌种类差异等问题一直困扰着精准用药。因此，为精准防控贵州地区发生的茶轮斑病，用5种生物农药对贵州茶园采样鉴定后的病原菌进行抑菌活性筛选，以期为贵州茶园茶轮斑病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病原菌 茶轮斑病病原菌由张欣等[9]于2020年7月从贵州省铜仁市石阡县采集，经形态学、分子生物学和毒性回接实验等鉴定该病菌为茶轮斑病病原(Pestalotiopsistrachicarpicola)，由贵州省农业科学院茶叶研究所提供。

1.1.2 药剂 寡糖-乙蒜素、嘧啶核苷类抗菌素等5种生物农药的名称、成分含量、剂型及生产厂家见表1。无水乙醇，购于天津市富宇精细化工有限公司；吐温80，购于天津市大茂化学试剂厂；土豆培养基(PDA)，购于广东环凯微生物科技有限公司；其他试剂均购于上海安耐吉化学试剂有限公司。药品称量，均在Sarfori-us型电子天平(精度:0.001 g)上完成。

表1 5种生物农药的名称、成分含量、剂型及生产厂家

1.1.3 仪器 超净工作台(苏净集团安泰公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；高温蒸汽灭菌锅(上海沉汇仪器有限公司)；BSA224S-CW电子天平；BHC-1300II A/B3生物洁净安全柜；Mill-Q型超纯水仪；20～200 μL、100～1 000 μL和1～5 mL移液枪等仪器。

1.2 试验设计

试验共设7个处理，根据生物农药的相应编号分设为处理1～处理5，处理6为对照药剂春雷霉素(有效成分2%，水剂/低毒，乳山韩威生物科技有限公司，CK1)，处理7为空白对照等量吐温80灭菌水(CK2)。每处理3次重复，随机排列。

1.3 试验方法

1.3.1 5种生物农药抗茶轮斑病的生物活性初筛

1) PDA培养基的配制。称量洗净去皮的土豆400 g放于锅中，加入2.5 L清水，煮开10 min停火，冷却10 min，然后用网布过滤掉土豆残渣，将土豆汁液与40 g琼脂、40 g葡萄糖、6 g磷酸二氢钾、3 g硫酸镁和20 mg维生素 B1混合均匀，最后以每瓶45 mL倒入100 mL的锥形瓶中封口，在121℃条件下高压灭菌 20 min，冷却备用。

2) 药液配制。在200 mL灭菌水中加入200 μL吐温80，搅拌均匀。在10 mL离心管中分别加入吐温80灭菌水1 mL，将5种生物农药分别称取5 mg分别溶解到离心管中，待其溶解均匀后再加入灭菌水4 mL，使其最终体积为5 mL。药液用PDA培养基45 mL混匀，使生物农药的最终质量浓度为100 μg/mL。将含有待测生物农药的PDA培养基平均倒入3个培养皿中冷却备用。

3) 病菌接种。将活化好的轮斑病病菌置于超净工作台，用打孔器于菌饼边缘打孔，制成直径为 4.0 mm的菌饼，然后用无菌接种针按试验设计要求将菌饼接种到含有各生物农药的培养基中。最后将培养皿放于25℃、80%湿度的恒温培养箱中培养5 d。待空白对照组生长至6.0 cm左右时，采用十字交叉法测试菌饼直径[12]，计算其抑制率(I)，筛选出抗茶轮斑病活性较高的生物农药。

I=[(C-T)/(C-0.4)]×100%

式中，C为空白对照菌丝测量直径，T为药物处理组测量直径。

1.3.2 活性较高生物农药抗茶轮斑病的EC50测定 根据5种生物农药对茶轮斑病抑制活性的初筛结果，在浓度100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL条件下，测定抑制活性较高生物农药的EC50，药剂对照(CK1)为春雷霉素50～800 μg/mL、空白对照(CK2)为等量吐温80灭菌水。利用菌丝生长速率法测定抑菌活性，采用十字交叉法测量生长后的菌丝直径，并计算抑制率，再对生物农药浓度取对数与其相应抑制率进行线性回归分析，从而得出EC50。根据EC50判断生物农药的毒力大小，即生物农药的EC50越小，对茶轮斑病病原菌的毒力越小。

1.4 数据处理

采用Excel 2010和DPS软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 5种生物农药对茶轮斑病的抑制活性

从表2可知，在100 μg/mL浓度下，5种生物农药对茶轮斑病菌的抑制率以处理1最高，为78.74%；处理4其次，为67.48%；处理5第三，为58.72%；处理3最低，为4.32%；CK1为18.70%，除比处理3高外均低于其余处理，各处理的抑制率差异均达极显著。说明，寡糖-乙蒜素、香菇多糖、申嗪霉素和嘧啶核苷类抗菌素4种生物农药对茶轮斑病菌的抑制活性均优于对照春雷霉素，其中以寡糖-乙蒜素、香菇多糖的效果最好。

表2 不同生物农药抗茶轮斑病菌活性的抑制率

2.2 寡糖-乙蒜素、香菇多糖对茶炭疽病的抑制率及EC50

2.2.1 抑制率 从表3可知，寡糖-乙蒜素、香菇多糖和春雷霉素在各浓度下对茶轮斑病菌的抑制率均达极显著差异，在试验浓度下均随药剂浓度减小对茶轮斑病的抑制率呈极显著减小趋势。在各浓度下抗茶轮斑病菌的抑制率以寡糖-乙蒜素最佳，浓度6.75～100 μg/mL的抑制率在20.20%～79.13%，比同梯度浓度下香菇多糖的抑制率分别高6.76百分点、12.28百分点、11.66百分点、12.26百分点和9.82百分点。寡糖-乙蒜素和香菇多糖在各浓度下的抑制活性均高于对照药剂春雷霉素，其抑制率和对应药物浓度均呈较好的线性关系，测定的EC50值可信度高。

表3 寡糖-乙蒜素、香菇多糖不同浓度对茶轮斑病活性的抑制率

2.2.2EC50从表4可知，寡糖-乙蒜素、香菇多糖的毒力回归方程的相关系数均>0.95，说明浓度与抑制率间均存在良好的线性关系。寡糖-乙蒜素和香菇多糖的EC50分别为25.32 μg/mL和43.31 μg/mL，分别比对照药剂春雷霉素的EC50(396.17 μg/mL)减少用药量370.85 μg/mL和352.86 μg/mL。说明，寡糖-乙蒜素对茶轮斑病的毒力强度最大，香菇多糖其次，寡糖-乙蒜素、香菇多糖抗茶轮斑病的效果均优于对照药剂春雷霉素。

表4 寡糖-乙蒜素、香菇多糖对茶轮斑病病原菌的毒力回归方程及EC50

3 结论

研究结果表明，在100 μg/mL浓度下，寡糖-乙蒜素、嘧啶核苷类抗菌素、丁子香酚、香菇多糖和申嗪霉素5种生物农药对茶轮斑病的抑制率，除丁子香酚外，其余4种均优于对照药剂春雷霉素(18.70%)，其中，以寡糖-乙蒜素的抑制率最高，为78.74%；香菇多糖其次，为67.48%，表明寡糖-乙蒜素和香菇多糖对茶轮斑病的抑制活性较佳。寡糖-乙蒜素、香菇多糖的EC50分别为25.32 μg/mL、43.31 μg/mL，分别比对照春雷霉素的EC50(396.17 μg/mL)减少用药量370.85 μg/mL和352.86 μg/mL。说明，寡糖-乙蒜素对茶轮斑病的毒力强度最大，香菇多糖其次，生产上防治茶轮斑病建议使用寡糖-乙蒜素。