河蟹颤抖病病原体的实验室检测

宫子慧，孙修云

(泗洪县水产技术推广站，江苏 泗洪 223900)

随着河蟹养殖规模不断扩大，各种病害也随之产生，其中颤抖病是较为常见、危害较严重的一种，此病又称“抖抖病”“环爪病”。该病1990年在我国出现，1997年后呈大规模流行，1998－1999年为发病高峰期，3－11月为主要发病季节，严重发病地区发病率＞90%，死亡率＞70%，对河蟹养殖业危害巨大(陈爱平等，2011)。螺原体对水生甲壳动物有广泛的侵染性，除河蟹外，在小龙虾、南美白对虾、罗氏沼虾及青虾中也相继发现螺原体病原。笔者以泗洪地区河蟹颤抖病发病塘的病蟹及同塘套养的青虾为检测对象，通过对发病样本肝胰腺中的细菌和肌肉中螺原体进行鉴定，以期为今后研究提供参考。

一、材料与方法

1.实验材料

(1)河蟹。采样时间为2020年8月13日，气温31℃，水温27℃，采集来自9例发病塘口的病蟹和两例同池套养的鲜活青虾。病蟹的症状为反应迟钝、行动缓慢、吃食减少甚至不吃食，病蟹离水后步足颤抖、环爪、腹部离开地面、附肢极易脱落，青虾为鲜活、无症状样本。采集的病蟹和青虾用采样箱加冰低温运送到实验室。

(2)主要试剂。Chel ex 100 sodium f or m购自SIGMA。2×EasyTaq PCR Super Mix购自北京全式金。核酸染料购自生工生物工程(上海)股份有限公司。DL2000 DNA Mar ker购自TaKaRa。螺原体引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒(比色法)(英文名API 20E)、氧化酶试纸购自梅里埃诊断产品(上海)有限公司。动物用药敏分析试剂板购自南京菲恩医疗科技有限公司。营养琼脂、TCBS琼脂、3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂购自北京陆桥技术股份有限公司。

2.方法

(1)螺原体DNA的提取及检测。取0.2克河蟹(青虾)肌肉组织，用剪刀剪碎，置于1.5毫升离心管内，加入200微升5%Chel ex100螯合树脂混匀液、20微升10毫克/毫升蛋白酶K溶液，混匀10秒，56℃恒温金属浴20分钟，混匀10秒，99℃恒温金属浴8分钟，12 000转/分离心4分钟，上清液即为待测样品DNA。PCR反应体系为50微升，包括2×EasyTaq PCR Super Mix 25微升、引物F1和F2各2微升、灭菌双蒸水20微升、DNA模板1微升。引物序列为F1：CGCAGACGGTTTAGCAAGTTTGGG和R1：AGCACCGAACTTAGTCCGACAC。PCR反应程序为：94℃预变性3分钟、94℃变性3秒、56℃退火15秒、72℃延伸10秒，35个循环，72℃延伸10分钟，4℃保温。对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统对271 bp的特异性靶片段进行检测。

(2)病原菌的分离、鉴定及药敏实验。用灭菌棉签蘸取河蟹肝胰腺，均匀涂于普通营养琼脂培养基和TCBS培养基上，分别置于28℃、37℃恒温培养18～24小时，观察菌落形态，并挑取单个菌落划线接种在营养琼脂平板和3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上，分别置于28℃、37℃恒温培养18～24小时。挑取纯化过的细菌制成0.5麦氏单位的菌悬液，采用肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒(比色法)系统测定各分离菌株生理生化特性；同时做氧化酶反应实验，36℃孵育18～24小时，根据判读表判读各反应结果，参照API微生物鉴定系统细菌检索手册，得到鉴定结果。用南京菲恩医疗科技有限公司的动物用药敏分析试剂板进行药敏实验。

二、结果

1.螺原体PCR检测结果

螺原体检测结果见图1，1～9号为病蟹检测结果，10～11号为青虾检测结果，PCR检测结果显示病蟹和青虾螺原体阳性检出率为100%。

图1 螺原体PCR检测结果

2.病原菌生理生化鉴定

对分离得到的5株细菌进行生理生化检测，结果判定为河流弧菌、荧光/恶臭假单胞菌、嗜水气单胞菌-1(细菌编码：7046104)、嗜水气单胞菌-2(细菌编码：7246104)、脑膜脓毒性金黄杆菌，具体生理生化特征见表1。

表1 鉴定试剂条检测结果

3.病原菌的药敏实验结果

5株细菌对8种抗菌药物的最小抑菌浓度如表2所示。

表2 细菌对8种抗菌药物的最小抑菌浓度 毫克/升

三、讨论与分析

本次实验从河蟹颤抖病样本和同池套养的鲜活青虾的肌肉中都分离到了螺原体，从病蟹肝胰腺中共分离到5个细菌分离株，并对8种抗菌药物进行敏感性测定。结果表明，河流弧菌、嗜水气单胞菌-1和嗜水气单胞菌-2对红霉素耐药，对其余7种抗菌药物敏感；荧光/恶臭假单胞菌对甲砜霉素、红霉素耐药，对氟苯尼考中敏，对其余5种药物敏感；脑膜脓毒性金黄杆菌对8种药物均敏感。虽然从病蟹样本中分离到了细菌，但有可能是河蟹感染螺原体后抵抗力下降的继发感染，造成河蟹颤抖病的病原应为螺原体。

河蟹颤抖病要以防为主，树立通过调控养殖生态环境，达到预防疾病发生的目的。池塘每年都要清淤，特别是上一年发生过病害的池塘，保证淤泥厚度小于5厘米，并曝晒池底，用生石灰或漂白粉彻底清塘。放苗后泼洒葡萄糖类产品，以提高扣蟹的活力和抗应激能力，注重饲料的蛋白质含量和维生素的添加，以保证营养的全面。

建立良好的河蟹养殖生态环境，保持水质清新，栽种苦草、轮叶黑藻、伊乐藻、狐尾藻等水草，水草栽种应体现多样性原则，定期用聚维酮碘等消毒剂消毒水体，高温季节要加深池水。进入5月定期用乳酸菌、芽孢杆菌、EM菌等微生物制剂改善水体环境，但要注意禁止与抗生素、消毒杀菌药或具有抗菌作用的中草药同用。要尽早使用微生物制剂，通过有益菌的大量繁殖，形成优势种群，与有害微生物竞争附着位置和养分，抑制病原菌的繁殖，微生物制剂也可以加速环境中有机质的分解，改善水质环境，保持水体清新。