GATA5抑制Ep CAM表达对肾癌HEK-293细胞系的影响

刘 诚石 嵩陈 文关建民

1.菏泽医学专科学校，山东菏泽 274000；2.菏泽市立医院，山东菏泽 274000

GATA5是调控器官发育的转录因子，含有2个典型锌指结构的DNA结合氨基酸序列（Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys），胚胎时表达并调控内胚层调控来源 的器 官发 育［1−4］。研 究发 现 在消 化道 肿 瘤 中GATA5作为抑癌基因发挥抑制癌症进展的作用［5］；同样在肝癌中发现GATA5能抑制肝癌细胞生长，促进肝癌细胞凋亡［6］。EpCAM作为癌干细胞因子在癌形成和进展中发挥重要作用［7−10］。GATA5是否在肾癌中发挥相应的作用还是未知，GATA5与EpCAM是否存在作用关系同样未知，我们选取肾癌HEK-293细胞，通过构建pTT5-GATA5研究过表达GATA5后对HEK-293细胞生长调控作用及观察GATA5对EpCAM表达调控作用。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

将HEK-293细胞系（购自武汉细胞库）培养在含有10%胎牛血清和5%青霉素/链霉素DMEM培养基中培养。细胞在37℃并含5%二氧化碳的培养箱中培养［11］。

1.2 实验方法

1.2.1 表达载体的构建 通过NCBI：NM_080473.4获取GATA5的cDNA（从63号碱基到1256碱基）。我们在N端添加了KozaK序列GCCACC。限制性位点HindIII（5'-A^AGCTT-3'）和NotI（5'-GC^GGCCGC3'）。通过PCR仪扩增合成cDNA-GATA5。用HindIII和NotI限制酶（Takara Bio Inc.Inc）酶切PCR产物，并通过T4DNA连接酶（Takara Bio Inc.Inc）连接到相同酶切的表达载体pTT5-vector（Biovector，Inc.USA）中。将重组pTT5-GATA5标签载体转化到大肠杆菌（DH5-α）中用于扩增［12］。

1.2.2 构建表达载体验证 将构建好的pTT5-GATA5载体，用HindIII和NotII限制酶（Takara Bio Inc）按照说明书进行酶切后，通过1%琼脂糖凝胶电泳进行大小验证。

将构建好的pTT5-GATA5质粒送往天一辉远公司进行碱基测序，使用测序引物5'-GCCATACACTTGA GTGACAA-3'和5'-GGGATCTCGACCAAATGATT-3'。

1.2.3 细胞转染 待细胞长至80%状态时，用Lipofectamine 2000转染试剂参照说明书将pTT5-vector，pTT5-GATA5转入细胞中，参考实验方法［13］。

1.2.4 MTT检测细胞增殖 将HEK-293细胞（1.5×104个/孔）铺在96孔细胞培养板上，每……