消胆胺通过激活肝内FXR信号靶向改善非酒精性脂肪性肝炎的机制分析

孙奕凡 臧淑妃* 杨传玉 汪丽红

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是单纯性脂肪肝（NAFLD）进展为肝硬化的限速步骤［1-2］。基于我国庞大的NAFLD人群和较高的NASH发生率，对NASH患者进行及时有效的干预具有重要意义。胆汁酸（BA）是由肝细胞以胆固醇为原料合成并分泌的具有两性结构的分子［3-4］，胆汁酸代谢异常与NASH的进展关系密切［5］。消胆胺（CHY）作为胆汁酸螯合剂，临床上用于降低胆固醇，基础实验中用于去除实验动物体内的内源性胆汁酸［4，6］，但其对代谢的影响尚不清楚。而法尼醇X受体（FXR）作为胆汁酸代谢关键分子，激活后可改善NASH炎症和纤维化［7］。本研究拟采用课题组前期建立的ApoE-/-小鼠NASH模型予以CHY干预，观察其对FXR的影响以及防治NASH的作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 造模及分组 40只SPF级6周龄雄性ApoE-/-小鼠平均分为4组，对照（LFD）组给予低脂饮食（LFD，货号98121701，品牌Research Diet，美国）喂养，NASH模型（HFHC）组给予高脂高胆固醇饮食（HFHC，货号D12079B，品牌Research Diet，美国）喂养，CHY对照（LFD+CHY）组给予低脂饮食+2%CHY（货号C4650，美国Sigma）喂养，CHY干预（HFHC+CHY）组给予高脂高胆固醇饮食+2%CHY喂养，连续喂养12周。

1.2 实验方法 （1）血液学指标检测：小鼠喂养12周后，采用戊巴比妥钠麻醉，心脏取血800～900 μL后，颈椎脱位法处死，立即无菌获取肝脏、肠道，液氮速冻并置于-80 ℃备用。血液置于1.5 mL离心管静置2 h后，以3000 r/min离心15 min，取上清，使用日立7180全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）等指标水平。（2）荧光定量RT-PCR：取肠道及肝脏组织约50 mg，采用TRIZOL/氯仿抽提法提取总RNA，抽提的RNA纯度、浓度均到达质控要求（浓度至少200 ng/μL，纯度1.9～2.0）后，使用罗氏逆转录试剂盒（批号：32460620，品牌：Roche，德国）cDNA第一链合成系统逆转录合成cDNA，以20 μL反应体系使用SYBR Green mix（批号：04913914001，品牌：Roche，德国）荧光定量，进行PCR扩增，通过2-ΔΔCT计算mRNA表达的相对水平。（3）油红O染色：新鲜肝脏冰冻切片，厚度10 μm，10%多聚甲醛固定40 min，PBS清洗3次，每次10 min，再经60%异丙醇漂洗30 s；采用新鲜现配6∶4油红O染色液染色15～20 min，60%异丙醇清洗3次，每次10 s，蒸馏水清洗10 s，苏木素复染核5 min，流水冲洗10 s，甘油明胶封片，光镜下观察拍照。（4）Western Blot：采用RIPA裂解法提取总蛋白，使用酶标仪采用BCA法测定所提蛋白的浓度，之后根据蛋白浓度及上样量，添加5X蛋白上样缓冲液，99 ℃加热10 min使蛋白变性，根据所测蛋白分子量配胶，40 ng蛋白量上样，上层胶80 V 30 min+下层胶120 V 2 h电泳，10%牛奶封闭1 h后一抗4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10 min，二抗室温孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min，应用化学发光成像系统进行图像采集、分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间均数比较采用ANOVA单因素方差分析；组间两两比较，方差齐者采用LSD或SNK法，方差不齐者采用Tamhane或Dunnett法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠的体质量、肝重及各项血清学生化指标比较 见图1。HFHC和LFD连续喂养12周后，HFHC组体重、肝体重比以及血清ALT、AST、TG、TC水平均明显高于LFD组（P<0.05）；与HFHC组相比，CHY+HFHC组小鼠的体重、肝体重比以及血清ALT、AST、TG、TC水平均显著降低（P<0.05）。

图1 A. 四组小鼠体质量比较；B. 四组小鼠肝体重比较；C. 四组小鼠的血清ALT水平比较；D. 四组小鼠的血清AST水平比较；E. 四组小鼠的血清TG水平比较；F.四组小鼠的血清TC水平比较；***P<0.001；**P<0.01，*P<0.05

2.2 各组小鼠的肝组织病理学结果 油红O染色结果显示，LFD组小鼠无明显脂肪变，HFHC组小鼠出现明显脂肪变；予以CHY干预后，LFD+CHY组和HFHC+CHY组的油红O染色面积、密度、染色程度均较对照组明显降低，说明CHY干预能够明显减轻肝内形成。见图2。

图2 各组小鼠的肝组织病理学结果

2.3 各组小鼠肝脏内炎症因子表达水平比较 与 HFHC组比较，HFHC+CHY组小鼠的肝内KC活化标志分子CD68（P<0.001）、F4/80（P<0.001）和炎症相关 分 子TNF-α（P<0.01）、MCP-1（P<0.001）、TLR4（P<0.05）的mRNA水平均显著下降，见图3 A-B。肝组织匀浆ELISA结果显示，HFHC+CHY组小鼠肝内TNF-α（P<0.01）、IL-1β（P<0.001）的表达水平均明显下降，见图3C。小鼠肝脏组织行IHC CD68与F4/80染色，结果显示HFHC+CHY干预组的CD68和F4/80阳性灶明显减少，说明CHY可改善HFHC诱导的KC活化，见图4-5。

图3 A-B. 各组小鼠肝内CD68、F4/80、TNF-α、MCP-1及TLR4的mRNA水平比较；C. 各组小鼠肝脏炎症因子TNF-α、IL-1β 水平比较

图4 各组小鼠肝脏组织CD68免疫组化结果（DAB×200）

2.4 各组小鼠肝脏内FXR及SHP mRNA信号分子表达水平比较 与LFD对照组比较，NASH模型组小鼠肝内FXR（P<0.001）、SHP（P<0.001）的表达均显著下调，经CHY干预后，FXR（P<0.01）、SHP（P<0.01）的表达均显著上调，见图6。Western blot实验结果显示，NASH模型组小鼠的肝内FXR信号受损，FXR、SHP分子蛋白的表达显著下降，经CHY干预后发生明显上调，见图7。

图5 各组小鼠肝脏组织F4/80免疫组化结果（DAB×200）

图6 各组小鼠肝脏FXR及相关分子SHP mRNA 的表达

图7 各组小鼠肝内FXR及SHP蛋白的表达水平

3 讨论

近年来，肠道菌群被认为是NASH“多重打击”中的一个重要环节［8］。饮食、药物、内源性激素等原因导致的菌群失调破坏肠道屏障功能，产生过度的内毒素和PAMPs［9］通过通透性增加的肠道屏障，经门静脉循环到达肝脏，激活肝内炎症的级联反应，可造成长期慢性的肝脏炎症损伤。有证据显示，NASH动物模型经CHY干预治疗可明显改变肠道微生物的菌群结构，减少肠源性内毒素和毒性代谢产物的产生与吸收，修复肠道屏障功能，恢复肠道的通透性，从而达到改善NAFLD/NASH的作用。胆汁酸作为肠道菌群代谢物的一种，具有体内FXR等受体的天然配体，其介导的生物学信号，尤其是FXR信号，可以通过抑制CYP7A1、CYP8B1两种胆汁酸合成酶的表达，从而负反馈调控胆汁酸的合成，在NASH的发展中起重要作用［10］。研究表明，敲除FXR可以破坏机体的糖脂代谢，促进肝脏的脂肪变性及炎症的进展，应用外源性FXR抑制或激动剂、或是消除内源性胆汁酸均可显著改善NAFLD的进展［11］。本研究试图验证CHY干预与FXR信号表达的关系，并探究其与HFHC诱导的NASH是否相关。

本研究发现，HFHC诱导12周的ApoE-/-小鼠出现明显的肝脏脂肪性变与炎症表现，转氨酶、血脂等血清学指标和CD68、F4/80、TNF-α等炎症因子水平表达均明显升高，且与肝脏组织病理学表现一致。经CHY干预后，HFHC模型小鼠的各项炎症指标均明显改善，病理学结果亦证明CHY干预能够减轻肝脏炎症。CD68与F4/80是Kupffer细胞的标志物，而Kupffer细胞募集和活化在NAFLD炎症的发生、发展中起着十分重要的作用［7，12］，提示CHY对炎症的改善作用可能与其对Kupffer细胞活化的抑制有关。另外，NASH模型小鼠出现肝内FXR信号相关分子的显著下调，包括FXR、SHP。经CHY干预后，NASH模型小鼠的FXR信号抑制状态得到明显改善，可能是CHY通过激活胆汁酸代谢过程中的FXR信号，减轻KC细胞的活化，抑制了NASH的发生发展。

综上，本研究证实CHY对NASH具有防治作用，为将CHY作为防治NASH的潜在药物提供了实验依据。