外源性激素对光棘球海胆性别相关基因dmrt1、foxl2和boule 表达的影响

胡彪，崔洲平，魏金亮，张健，王娅，张伟杰，孙志惠，常亚青

（大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023）

光棘球海胆Mseocentrotus nudus（又称大连紫海胆）唯一可食用的性腺味道鲜美、营养丰富、市场价值高，是我国重要的海产经济海胆之一[1]。

类固醇激素（Steroid hormone）（甾体激素）在维持生命、调节性功能以及繁殖调控等方面行使重要功能，其中性激素，尤其是雌二醇和睾酮在动物的性别分化及性腺发育中发挥重要作用。用外源17β-雌二醇处理，可促进小鼠卵母细胞的体外成熟[2]，用外源性17α-甲基睾酮处理能够促进生长前期的卵泡发育，后期则呈抑制作用[3]；用外源17α-甲基睾酮处理会导致斑马鱼Danio rerio 雌鱼发生性逆转，其性腺表型由卵巢转变为精巢[4]。用外源性17β-雌二醇处理会导致斑马鱼种群的雌性比例上升，雄鱼第二性征减弱，部分雄鱼发育出卵巢样的性腺[5]；同样，外源性17β-雌二醇也能促进青鳉Oryzias latipes 朝雌性发育[6]。在外源性17α-甲基睾酮处理下正常雌性虹鳟Oncorhynchus mykiss可被诱导为性腺组织与卵巢类似的伪雄性[7]。无脊椎动物中，是否存在与脊椎动物类似的性激素尚有争议[8-10]。用外源雌二醇浸泡处理可促进贻贝Elliptio complanata 卵黄蛋白原基因表达[11]。红海盘车Asterias rubens 性腺中检测到雌二醇和孕酮，且其激素水平与卵巢发育息息相关[12]；在同属海胆纲的巨紫球海胆Strongylocentrotus franciscanus 中，Botticelli 等[13]利用蒸馏、层析等方法，证实巨紫球海胆性腺中存在雌激素，且17-β 雌二醇活性最强。然而，作为我国市场价值较高的光棘球海胆性腺中是否存在性激素尚不明确；性激素在该海胆性腺发育中的作用也有待探究。

性腺的发育需要众多性别相关基因相互作用、共同调控。其中dmrt1 基因是目前已知最为保守的、与雄性性别决定和精巢发育相关的关键基因[14]。foxl2 基因则是进化上高度保守，与卵巢分化和维持相关的基因[15,16]。boule 基因隶属于DAZ 基因家族，是多个物种生殖细胞的标记基因[17,18]。研究表明，用外源性雌二醇与睾酮处理对不同物种的dmrt1 和foxl2 基因表达的影响不同，如雌二醇处理会降低中华鳖Pelodiscus sinensis 成体dmrt1 基因表达[19,20]，而使成体与早期胚胎的foxl2 基因表达上调；用外源雌二醇处理会导致斑马鱼dmrt1 基因表达量显著上升[21]，导致大黄鱼Larimichthys crocea foxl2 基因表达下调[22]。用外源睾酮处理后，半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis 会发生性逆转，其性别表型由雌性逆转为雄性，由卵巢转化成的精巢中可以检测到dmrt1 基因的表达[23]；外源睾酮处理后，中华鳖雌雄个体中foxl2 基因表达上升[20]。而针对外源性激素对boule 基因表达影响的研究较少，雌二醇与睾酮对boule 基因表达的影响尚不明确。

在前期研究中，克隆获得了光棘球海胆dmrt1、foxl2 和boule 基因，发现dmrt1 基因在光棘球海胆性腺中呈现雄性特异性表达，foxl2 和boule 基因在光棘球海胆性腺中均呈现差异性表达，在精巢中表达量分别为卵巢中的6 倍和25 倍。本研究通过检测光棘球海胆性腺中雌二醇、睾酮和孕酮的含量，通过向海胆体内注射17β-雌二醇或17α-甲基睾酮，分析海胆性腺中dmrt1、foxl2 和boule 基因的表达变化，可为进一步研究激素对光棘球海胆性腺发育的影响提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

试验所用光棘球海胆由大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室自行繁育。随机选取60 只，初始直径（3.47±2.27）cm，初始质量（25.04±1.75）g，养殖于循环水槽中，每天半量换水，每3 d 换水1 次，投喂海带及常见藻类。

试验药品为17β-雌二醇（sigma，E8875-250）和甲基睾酮（sigma，M7252-1）溶解于1 mL 无水乙醇，制成10 mg/mL 的母液，然后用葵花籽油稀释成1 mg/mL 的应用液。

1.2 方法

取6 只海胆解剖收集体腔液，于4℃1 000 r/min 离心20 min，分离体腔液上清，保存于超低温冰箱（-80℃），用于检测激素含量。收集海胆的部分性腺组织于无酶离心管中，用液氮速冻后保存于超低温冰箱（-80℃）中，用于检测激素含量。剩余的性腺组织于4%Perfluoroalkoxy（PFA）中，4℃固定过夜；第2 d 用PBS 摇洗三次，每次5 min，完成后用30%蔗糖于4℃渗透过夜；第3 d 用组织包埋剂OCT（Tissue-Tek，上海）包埋，保存于超低温冰箱（-80℃）中用于制作冰冻切片样品。

将60 只海胆随机分为三组,饲养在用网分隔成三个区域的室内1 000 L 水槽中：每天用25 μL 微量注射器由围口膜处注射10 μL 雌二醇应用液（雌二醇组）、睾酮应用液（睾酮组）和葵花籽油（对照组）。

持续注射14 d 后，测量每组存活海胆的重量和壳径，解剖、收集海胆的体腔液，于4℃1 000 r/min离心20 min，分离体腔液上清，保存与超低温冰箱（-80℃），用于检测激素含量。收集海胆的消化道和部分性腺于无酶离心管中，液氮速冻后保存于超低温冰箱（-80℃）中，用于检测激素含量及基因表达。部分性腺于PFA 中4℃固定过夜用于制作冰冻切片样品。

1.2.1 性腺组织切片观察

样品处理：将包埋后的光棘球海胆性腺样品用冰冻切片机（LeicaCM1900-1-1）进行冷冻切片；将玻片于37℃烘箱中烘烤1 h。

样品固定：将烘干的载玻片置于装满PBS 的卧式染缸中，室温摇洗2 次，每次5 min；用4%PFA 固定样品；随后用PBS，室温摇洗2 次，每次5 min，洗去多余的PFA。

染色：将固定后的载玻片用蒸馏水冲洗2～3 min；苏木精染色15 s；自来水冲洗，洗去浮色；1%盐酸酒精（1 mL 浓盐酸加入99 mL70%无水乙醇）分化3～10 s，切片变红，颜色变浅。

水洗终止分化：自来水摇洗10 min，反蓝；伊红染色1 min；蒸馏水冲洗；70%乙醇30 s；80%乙醇1 min；90%乙醇2 min；甘油封片。

镜检：使用Leica DM4B 镜检观察并拍照。

激素测定：采用酶联免疫吸附技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测性腺和体腔液中雌二醇、睾酮和孕酮的含量。按照试剂盒说明书步骤进行测定操作。使用cpectraMax i3x（MOL ECULAR）酶标仪检测激素含量。

1.2.2 相关基因表达量的测定

总RNA 的提取及cDNA 的合成：参照SV Tolal RNA laolation System（Promaga Z3100）说明书提取总RNA，随后用琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计（BiochromLtd 公司，英国）检测RNA 质量。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaRaKa634860）试剂盒将总RNA 反转录为cDNA。实验步骤严格按照试剂盒说明书步骤进行。

荧光定量PCR 检测相关基因的表达：用Light-Cycler96 Instrumen（tRoche，美国）进行实时荧光定量分析dmrt1、foxl2、boule 基因的表达，以Ubiquitin为内参基因。荧光定量PCR 所用引物由http://biotools.nubic.northwestern,edu/OligoCalc.html 网站设计（表1），所用荧光DNA 聚合酶为SYBR Green I Dye。所用体系如下：FastStart Essential DNA Green Master 10 μL，上下游引物各0.8 μL，无菌水6.4 μL，cDNA 2 μL，共20 μL。反应程序为：94℃预变性10 min；94℃15 s，60℃60 s，72℃1 min，35 个循环；72℃延伸10 min。采用2－△△Ct法计算基因的相对表达量。

表1 荧光定量PCR 引物序列Tab.1 Sequence of the primers used for real-time PCR

2 结果与分析

2.1 光棘球海胆性腺及体腔液中性激素的含量

光棘球海胆性腺发育主要分为恢复期、生长期、成熟前期和成熟期四个时期[24]。处于不同发育时期的性腺内各类细胞分布均有所差异。经苏木精-伊红染色后，恢复期的性腺中，充满了染色较浅的营养吞噬细胞，而染色较深、分布稀少的则为卵原细胞和精原细胞；生长期的性腺中，营养吞噬细胞位于生殖腺中部，卵原细胞和精原细胞则排列于生殖腺滤泡壁；在成熟前期性腺中，仍然可见营养吞噬细胞；成熟的卵母细胞和精母细胞开始向生殖腺中央转移；在成熟期的性腺中，营养吞噬细胞变少，成熟的卵子和精子占据了绝大空间。通过苏木精-伊红染色和镜检，对光棘球海胆性腺发育情况进行了发育分期判定，检测了成熟期的雄性（图1-A 和图1-B）和雌性（图1-C 和图1-D）个体体腔液和性腺中的睾酮、雌二醇以及孕酮的含量。

图1 光棘球海胆性腺组织学检测Fig.1 Histological observation of the gonads of sea urchin Mseocentrotus nudus

结果表明，在光棘球海胆的性腺中，睾酮含量存在极显著的性别差异。精巢中睾酮的含量是卵巢中的2.99 倍（表2）。但是，雌二醇和孕酮在卵巢中的含量显著高于精巢中，其中卵巢中雌二醇的含量是精巢中雌二醇含量的1.87 倍，孕酮的含量是精巢的2.35 倍（表2）。在光棘球海胆的体腔液中没有检测到以上三种激素的存在。

表2 光棘球海胆性腺中雌二醇、睾酮和孕酮的激素的含量Tab.2 Contents of estradiol（E2）,testosterone（MT）and progesterone（PROG）in the gonad of sea urchin Mseocentrotus nudus

2.2 雌二醇处理对光棘球海胆性腺中性别相关基因表达的影响

考虑到睾酮和雌二醇在光棘球海胆性腺中的表达差异显著，采用注射外源激素的方式探讨了性激素在光棘球海胆性腺发育中的功能。持续注射雌二醇14 d 后，荧光定量PCR 检测表明，光棘球海胆精巢中dmrt1 基因的表达量较对照组显著降低70.8%；foxl2 基因的表达量与对照组无显著差异（图2-A）。dmrt1 基因在对照组与雌二醇处理组卵巢中均不表达；雌二醇处理后，foxl2 和boule 基因的表达量较对照组显著上调，分别升高了2.25 倍和6.41倍（图2-B）。

图2 雌二醇处理对光棘球海胆性腺中性别相关基因表达量的影响Fig.2 Effect of estradiol injection on sex-related gene expression level in the gonads of sea urchin

2.3 睾酮处理对光棘球海胆性腺中性别相关基因表达影响

持续注射14 d 睾酮后，光棘球海胆卵巢中dmrt1 基因在对照组与雌二醇处理组中均不表达，foxl2 基因的表达量较对照组显著升高约2.66 倍，boule 基因较对照组显著上调约3.10 倍（图3-A）；光棘球海胆精巢中dmrt1 和boule 基因的表达量较对照组显著降低了72.6%和71.0%（图3-B），foxl2基因的表达量与对照组无显著差异。

图3 睾酮处理对光棘球海胆性腺中性别相关基因表达量的影响Fig.3 Effect of testosterone injection on sex-related gene expression level in the gonads of sea urchin

3 讨论

本研究利用ELSA 实验证实，在光棘球海胆精巢和卵巢中均检测到雌二醇、睾酮和孕酮三种性激素，且存在明显的性别差异。精巢中睾酮的含量较高，而卵巢中雌二醇和孕酮的含量较高。雌二醇是生物活性最强的雌激素，在维持雌性第二性征中发挥重要作用[25]。哺乳动物黄体产生的孕酮可以与雌激素共同维持雌性生殖系统的正常功能。睾酮对促进性器官发育、精子发生和早期卵泡发育，以及维持第二性征等具有重要意义[26]。浓度为50 ng·L-1以上的甲基睾酮可以有效地提高稀有鲫Gobiocypris rarus 的性腺指数，促进性腺发育[27]。外源性甲基睾酮可以诱导鲻Mugil cephalus L.雄性精子发生与精子形成[28]。海胆Paracentrotus lividus 和海星Asterias vulgaris 配子发育也与性激素水平息息相关[29,30]。性激素可能在光棘球海胆性别分化与性腺发育过程中也发挥类似的重要的调控作用。

外源性激素处理影响物种的性别分化、性腺发育、性别表型等及性别发育信号调控通路中的基因表达。在本研究中，雌二醇和睾酮处理均能显著降低光棘球海胆dmrt1 基因表达，这与中华鳖及半滑舌鳎中的研究结果一致[19-23]。无论使用雌二醇处理，还是用睾酮处理，均能提高雌性海胆性腺中foxl2基因的表达。高丽丽等发现，雌二醇和睾酮均能促进中华鳖foxl2 基因的表达[20]。这可能是外源性睾酮在海胆体内可能转化为了雌二醇，使与精巢发育相关的基因表达量下调，而与卵巢发育和维持相关的基因上调表达。雌二醇和睾酮处理均能够使雌性海胆卵巢中boule 基因的表达量升高。boule 基因作为生殖细胞标记基因，其上调表达意味着生殖细胞数目或者体积增加。在中间球海胆中，注射雌二醇可显著提高海胆的性腺指数[31]。推测使用雌二醇和睾酮处理可能会促进雌性光棘球海胆的性腺发育。本研究为解析性激素的进化奠定基础，可为更好地了解雌二醇与睾酮对光棘球海胆性别控制方向的影响，为未来单性养殖棘皮动物提供参考。