多重PCR检测在肠道致病菌检测中的作用

饶小惠

（大埔县人民医院，广东 梅州 514229）

感染性腹泻是临床常见的腹泻类型，具有较高的发病率与流行性，其中沙门菌和志贺菌是感染性腹泻发生的重要肠道致病菌[1]。临床发现，及时确定肠道致病菌类型对于疾病治疗和康复具有重要的临床意义。目前临床对于腹泻患者多采用常规细菌鉴定法检测，虽具有一定的效果，但是存在操作步骤复杂、检测耗时长等缺点。而随着医疗科技的不断完善，发现荧光定量PCR 法通过检测沙门菌和志贺菌DNA 来检测腹泻感染也可取得理想的检查效果。但是目前临床对于荧光定量PCR 法和常规细菌鉴定法对肠道病原菌（沙门菌和志贺菌）的阳性检出符合率是否统一尚未明确[2]。鉴于此，本文将60 例患者进行分析，总结荧光定量PCR 法与常规细菌鉴定法的方法，试探讨其患者肠道致病菌检测的影响，详细报告内容请看下文。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究例数有60 例，研究时间在2020年1月-2020年12月，研究对象是腹泻患者，60 例患者中男女的比例为33:27；患者年龄主要集中在6 个月-68 岁，平均（34.56±10.24）岁。对比分析患者的各项资料，具有可比性（P＞0.05）

纳入标准：①60 例患者经临床检查确诊为腹泻；②患者神志清醒，能够进行简单的交流，可以配合完成检测；③患者及家属签字同意参加研究，并且获取医学委员会的审核通过。

排除标准：①患者的心肝肾等器官存在严重器质性病变；②患者并发严重全身感染；③患者的精神异常，不能正常交流，无法配合完成检查；④患者的病历资料不齐全或者不愿参加研究。

1.2 方法

①60 例患者展开常规细菌鉴定法检测，具体检测方法为：訩标本采集：患儿入院后，护士告知家属粪便收集方法，并为家属发放粪便收集器，采用5 支无菌棉擦拭多点采集粪便标本，采集完新鲜的大便标本后，立即将其置入无菌盒中，并送往检验科进行检测。訪检测方法：培养温度设置为35oC，培养时间大约为18-24 小时，之后采用划线的方法接种到SS琼脂、XLD 琼脂，并在平板培养基中进行培养，培养基的温度保持在37oC，仔细观察致病菌的颜色变化情况，对于少数可疑病菌，可将其进行涂片和染色处理后进行固定制片，采用显微镜进行观察，必要时可进行血清血凝集试验，直至鉴定出致病菌。②60 例患者展开荧光定量PCR 法检测，详细检测过程为：訩采用一次性多功能采样器收集患者的肛拭子，将收集的标本放入沙门菌-志贺菌增菌液中进行增菌，增菌时间在3 个小时到5 个小时；訪使用一次性滴管吸入增菌液，并在1.5ml 的无菌离心管中滴入2 滴增菌液，将20 人份的肛拭子增菌液置入同一个1.5ml 的无菌离心管中，然后进行离心分离，离心速度设为每分钟10000r，离心时间为3 分钟，离心分离结束后去掉上清，并保留50μl 的低层液；訫在试管中加入50ml 的DNA 提取液，等到液体沉淀悬浮后开大火进行煎煮，温度设为100oC，煎煮时间为5 分钟，然后进行二次离心分离，离心时间为3 分钟，离心速度为每分钟10000r，之后将5μl 上清液滴入灭菌离心管中；④选择济南好来宝医疗器材有限公司生产的荧光定量PCR 仪（型号为：CFX Connect）进行扩增，反应体系设为25μl；检测途径：沙门菌FAM，志贺菌VIC；循环参数设为：每3 分钟94℃作为一个循环；每30秒93℃至每45 秒55℃为44 个循环。

1.3 观察指标

比较荧光定量PCR 法与常规细菌鉴定法的检测结果，仔细记录两种方法中沙门菌和志贺菌的例数。

1.4 统计学方法

研究所得数据均录入至Excel 2010 中予以校对，采用SPSS 23.0 软件进行处理。百分比（%）表示计数资料，计数资料用卡方（χ2）检验。P评定检验结果，P＞0.05 提示无统计学差异，P＜0.05 提示有统计学差异。

2 结果

2.1 评价分析两种检测方法在沙门菌阳性率的差异

从表1 的结果能够看出，在沙门菌阳性率上，荧光定量PCR 法为8.33%，常规细菌鉴定法为5.00%，荧光定量PCR法略高于常规细菌鉴定法，差异不大（P＞0.05）。

表1 评价分析两种检测方法在沙门菌阳性率的差异[n(%)]

2.2 评价分析两种检测方法在志贺菌阳性率的差异

从表2 的结果可以发现，荧光定量PCR 法检测的志贺菌阳性率为6.67%，常规细菌鉴定法检测的志贺菌阳性率为3.33%，荧光定量PCR 法略高于常规细菌鉴定法，比较差异不大（P＞0.05）。

表2 评价分析两种检测方法在志贺菌阳性率的差异[n(%)]

3 讨论

腹泻是临床上比较常见的疾病，也是患者营养不良的影响因素，不利于患者的正常生长发育。腹泻主要是指由多种病因引起的以腹泻为主的一类疾病，具有病因多样、流行范围广、缺乏有效预防措施的特点，5 岁以下的儿童是该疾病的主要发病人群，临床上主要表现为腹痛、大便次数增多、发热等症状，给患者的日常生活带来不良影响[3]。患者发生腹泻后，若是没有及时采取有效、正确的治疗措施，可能会对患者的生命安全构成威胁，已经是造成发展中国家婴幼儿死亡的重要原因之一，成为全球重要的公共卫生问题，对社会稳定、经济发展以及人们的生活、工作产生巨大的损害[4]。肠道感染是腹泻发生的重要原因，而沙门菌和志贺菌是临床比较常见的肠道致病菌，其中沙门菌是寄生在人类肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰阴性杆菌；而志贺菌又被成为痢疾杆菌，是人类细菌性痢疾的病原菌，可在人与人之间广泛传染[5]。沙门菌与志贺菌主要是由于食用受到污染的食物或者饮用受到污染的水源引起的，具有传染性[6]。因此，选择合理有效的诊断方式对于疾病的防治具有重要的意义。

常规细菌鉴定法是临床检测沙门菌和志贺菌的常用方法，其通过细菌培养、生化鉴定、血清检测等进行鉴别诊断，可有效检测出沙门菌和志贺菌；但是，常规细菌鉴定法的检测过程复杂，获取检测报告的等待时间长，需要用到的试剂比较多，对检验科人员的技术要求极高，且受到外界因素的影响较大，限制了临床应用范围[7]。随着分子生物技术的发展与完善，荧光定量PCR 法逐渐用于微生物的鉴别诊断中，取得了较好的检测效果，目前已在感染性疾病中广泛应用[8]。荧光定量PCR 法是聚合酶链式反应是一种实验室检测，利用一段DNA 为模板，在DNA 聚合酶和核苷酸底物作用下，将该段DNA 扩张至足够数量，以便进行结构和功能分析[9]。相较于常规细菌鉴定法，荧光定量PCR 法将20 人份的样品合成一个上机样品，降低了成本，使得价格能够为患者所接受。本次研究发现，在沙门菌阳性率和志贺菌阳性率上，多重荧光定量PCR 法略高于常规细菌鉴定法（P＞0.05），这与李芬[10]的研究报告结果较为一致，说明采用荧光定量PCR 法检测肠道致病菌的效果显著，且安全可靠。

综上所述，多重荧光定量PCR 法用于肠道致病菌检测的效果理想，可以快速检测出肠道致病菌类型，为疾病诊断和治疗提供了依据，具有较好的临床推广意义。