抗乙酰基转移酶TIP60单克隆抗体的制备与鉴定

刘树玲,赵陶然,陆 昕,米腊腊,赵兴卉,刘志贞*

(1军事科学院军事医学研究院生物工程研究所,北京 100071;2山西医科大学基础医学院,出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室;3山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室;4山西医科大学基础医学研究中心;#共同第一作者;*通讯作者,E-mail:zhizhenliu2013@163.com;**共同通讯作者,E-mail:xinghui-zhao@163.com)

Tat相互作用蛋白60(Tat-interactive protein 60,TIP60)也称作KAT5或HTATIP,是乙酰基转移酶MYST(MOZ,YBF2,SAS2和TIP60)家族的成员之一。TIP60蛋白由N端染色质桶装结构域(TIP60-CB)和C端乙酰化结构域构成,其中C端乙酰化结构域中含有一段保守的MYST乙酰基转移酶结构域,该结构将乙酰基从乙酰CoA转移到底物赖氨酸的α-氨基上[1],实现蛋白的乙酰化修饰。

TIP60能够催化一系列组蛋白的乙酰化,如H2A的K5,H3的K14,H4的K5、K8、K12、K16,但并不能乙酰化H2B[2]。除此之外,TIP60还可以乙酰化一系列转录因子及DNA损伤反应相关蛋白,如c-Myc[3]、STAT3[4]、E2F1[5]、ATM[6]、C/EBPα[7]和p53[8]等。因此,TIP60在DNA损伤修复[9,10]、检查点激活[6]、p53指导的细胞凋亡[11,12]、衰老和自噬[13]等过程中发挥关键作用。此外,TIP60还在Ras/p38信号传导[14]和胰岛素/AKT信号传导[15]等信号转导途径中起着重要的中介作用[16]。

我们在TIP60与转录因子相互作用的研究中,为了检测细胞内的TIP60蛋白水平以及免疫共沉淀捕获TIP60相互作用蛋白,使用商品化的抗TIP60抗体,但效果均不理想。为了解决这一问题,我们分析了TIP60蛋白结构,选取N端一段氨基酸序列合成多肽,作为抗原免疫小鼠,并通过亲和层析纯化,成功制备了抗TIP60单克隆抗体。

1 材料与方法

1.1 材料

雌性8周龄BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂购自Sigma-Aldrich(USA)公司,骨髓瘤细胞(SP2/0)、293T细胞、大鼠巨噬细胞RMa-bm、小鼠巨噬细胞RAW264.7为本室保存。……