基于ISSR分子标记的湖北野生夏枯草遗传资源分析

董元火白雪依廖新安夏恒建张文才王圣军彭仕梅郭双喜

(1.江汉大学生命科学学院/湖北省汉江流域特色生物资源保护开发与利用工程技术研究中心，湖北 武汉 430056；2.湖北省蕲春县科学技术和经济信息局，湖北 蕲春 435399；3.李时珍医药集团有限公司，湖北 蕲春 435399；4.蕲春县中医药产业发展中心，湖北 蕲春 435399)

2021年7月9日，习近平总书记主持召开中央全面深化改革委员会第二十次会议，审议通过了《种业振兴行动方案》。会议强调必须推进种业振兴，必须把民族种业搞上去，把种源安全提升到关系国家安全的战略高度，实现种业科技自立自强、种源自主可控。

种质资源，又称遗传资源或基因资源，是培育作物和中药材优质、高产的物质基础，是维系国家食物和药品安全的重要保证[1]。中医药作为我国独特的卫生资源，在经济社会发展和促进人类健康中发挥着重要作用。种质资源是中药材生产的源头，种质的优劣对中药材产量和质量有决定性作用[1]。种质资源的遗传多样性是其影响中药材质量的根本内在机理，研究保存物种的遗传多样性对其种质资源的保护与利用以及育种有重要意义[2]。保护遗传多样性是生物多样性保护工作中最根本的任务，也是实现可持续利用发展战略的基本保障。

夏枯草(Prunella vulgaris L.)隶属唇形科夏枯草属，因“夏至后即枯”得名，是常见传统中药之一。干燥果穗是主要的药用部位，干燥果穗入药称“夏枯球”，全草入药称“夏枯草”。有清热明目、泻肝火、清热散结、降压、降糖、抗菌、抗炎、抗过敏、抗病毒及增强免疫力等功效[3]。2011年已被湖北省科技厅列为全省优先发展的3大主要优势品种之一[4]。蕲春夏枯草，为国家地理标志产品，是蕲春精准脱贫的重要产业。

目前，夏枯草的研究主要涉及药材鉴别、化学成分、药理作用、产品开发、生态学和种植等方面[4,5-10]，而夏枯草野生遗传资源的状况和评价研究报道相对较少，董元火等[11]基于迷迭香酸的含量评价了湖北夏枯草野生种质资源。中药材野生品与栽培品的研究表明，野生与栽培药材既存在差异又体现共性；野生品与栽培品既有质量差异大的品种，如丹参、天麻、鱼腥草等[12-14]，又有质量等同的品种，如防风、黄芩等[15,16]，这与种质资源密不可分。种质资源是药材生产的源头，种质的优劣对产量和质量具有决定性的影响。本研究拟基于ISSR分子标记的遗传多样性评价野生夏枯草种质资源，为夏枯草种质资源保护和品种改良、中药材品质的提高奠定基础，助力夏枯草产业在乡村振兴中发挥重要作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究的材料分别采自湖北的武汉、蕲春、襄阳和崇阳4个地方。根据研究所需，保证取样间距5m以上，随机采取夏枯草幼嫩叶片并用硅胶保存。提取夏枯草干燥叶片中的DNA，保存于-20℃冰箱中。由于襄阳和崇阳种群相对较小，因此该两种群所取样本较少。具体样品数及相关信息见表1。

表1 基于ISSR分析的4个野生夏枯草种群的样品信息

1.2 试验方法

1.2.1 夏枯草基因组DNA的提取及检测

采用改进的CTAB法[17]提取夏枯草叶片中的基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白分析仪(Eppendorf BioPhotometer plus，Eppendorf AG，Hamburg，Germany)分别测定其纯度和浓度，选取260/280处OD值在1.8～1.9的DNA样品进行ISSR-PCR扩增及分析。

1.2.2 ISSR-PCR扩增

从4个夏枯草种群中分别取1个DNA样品，共选取4个DNA样品进行引物筛选，所用ISSR引物是加拿大哥伦比亚大学公布设计的序列，具体见表2。PCR扩增后，对比可重复性、多态性及清晰度后，筛选确定扩增效果良好的引物。采用的PCR扩增仪为PTC-100TMthermocycler(MJ Research，Inc)。PCR反应体系参考廖丽等[18]研究方法，并作适当改进。

ISSR-PCR反应体系(25μL)：含有13μL双蒸水，2.5μL(2.5mmol·L-1)dNTP，2.5μL 10×PCR Buffer(含10mmol·L-1Tris-HCl，1.5mmol·L-1MgCl2和50mmol·L-1KCl)，1.0μL(25mmol·L-1)MgCl2，0.5μL Taq Polymerase，1.5μL引物(25pmol)，4μL模版DNA。

PCR反应参数：94℃预变性5min；接35个循环，每个循环为94℃变性30s，53℃复性(退火)45s，72℃延伸1.5min；最后72℃延伸7min。

DNA样品PCR扩增完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，再经紫外凝胶成像系统检测。

1.2.3 数据统计与分析

将ISSR-PCR产物电泳所有的条带进行统计，同一位点条带有标记为1，无标记为0。采用POPGENE32软件[19]进行数据分析，主要统计参数包括多态位点百分率(PPB)、Nei′s基因多样性(Ht)、Shannon′s信息指数(I)、遗传一致性和遗传距离。采用MEGA7.0.26软件，基于Nei′s的遗传距离，构建4个种群的UPGMA聚类图。

2 结果与分析

2.1 ISSR有效引物

从50个引物中，根据可重复性、多态性及清晰度，筛选确定扩增效果良好的9个引物，具体见表2。

表2 ISSR引物序列以及每条引物扩增带的情况

2.2 PCR扩增结果

利用筛选出的引物对夏枯草所有21个样品进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳系统检测显示，其检测部分结果如图1所示。

图1 引物809对部分DNA样品扩增的ISSR电泳图

2.3 遗传多样性

根据凝胶电泳图谱条带，采用POPGENE32分析显示，武汉种群内(WHX)和蕲春种群(QCX)多态性位点(PPB)分别为78.95%和75.44%，2个种群的遗传多样性比较高，而崇阳种群(CYX)遗传多样性最低，多态性位点为43.86%，具体见表3。4个种群总共的多态性位点为98.25%，物种水平Nei′s基因多样性(Ht)和Shannon′s信息指数(I)分别为0.37和0.54。QCX和WHX种群间的遗传一致性最大(0.8972)，与2个种群间遗传距离最小的结果相吻合。CYX与QCX种群间的遗传一致性最小(0.7323)，与之相适应的二者间的遗传距离性最大(0.3115)，其结果也相互应证。基于Nei′s的遗传距离UPGMA聚类图显示崇阳种群(CYX)单独分为一支，具体见图2。

表3 基于ISSR标记分析的4个夏枯草种群遗传多样性水平

表4 4个种群的Nei氏遗传一致性和遗传距离

图2 基于Nei′s遗传距离的4个野生夏枯草种群的

3 讨论与结论

种质资源遗传多样性是利用基因资源的基础和引种、栽培及资源保护的基础。从资源保护和利用的角度，必须要尽量多地保留遗传多样性[20]。在本研究中，ISSR分析显示武汉种群内多态性位点有78.95%，蕲春种群内多态性位点有75.44%，襄阳种群内多态性位点有52.63%，崇阳种群内多态性位点为43.86%，表明武汉和蕲春的野生夏枯草的遗传多样性较高。因此，要更好地保护其高的遗传多样性种群，同时，在开展夏枯草“野转家”种植时应该优选考虑蕲春和武汉各种群夏枯草种植及技术研究，有效解决因长期人工大规模种植导致的产量和品质下降的问题。4个种群总共的多态性位点有98.25%，物种水平Nei′s基因多样性(Ht)和Shannon′s信息指数(I)分别为0.37和0.54，表明夏枯草在物种水平存在高水平的遗传多样性，具体见表3。与沈宇峰等[21]利用AFLP分子标记技术研究的夏枯草种质资源遗传多样性中揭示的多态位点百分率93.91%结果相似，这说明基于ISSR分子标记的遗传多样性分析结果相对比较可靠，该技术可以有效运用在大多数植物的遗传多样性分析中。物种适应环境和保持进化潜力的物质基础是遗传变异，一个物种的分布广泛与否、种质资源丰富与否都与该物种自身的遗传多样性有关。本研究显示，武汉种群和蕲春的夏枯草的多态位点百分率高，表明遗传多样性较高，遗传资源丰富，而崇阳夏枯草多态位点百分率最低，为43.86%，遗传多样性最低，遗传资源相对不丰富，与崇阳夏枯草种群较小(种群面积20～30m2)有关。因此，要通过种群更新、恢复、扩繁及野生种质资源交流，提高其遗传多样性。