Tau蛋白显像剂的研究进展

于 倩，李钰莹，彭 程

(1.首都医科大学宣武医院 放射学与核医学科，北京 100053；2.放射性药物教育部重点实验室 北京师范大学 化学学院，北京 100875)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)作为一种进行性发展的神经退行性疾病，是一种最常见的痴呆形式，约占痴呆疾病的60%～80%。其临床症状主要表现为记忆和认知功能受损，日常生活能力持续减退并常伴有神经障碍，被认为是威胁老年人生命健康的主要“杀手”之一[1-2]。目前，AD的致病机理尚不明确，且无准确的诊断手段和有效的治愈方法。Tau蛋白异常磷酸化假说[3-4]在近年来受到了广泛的关注。该假说认为Tau蛋白的异常磷酸化致使其生物功能受损，大量异常磷酸化的Tau蛋白在神经细胞内聚集缠绕，最终导致神经突触损伤和神经元死亡。此外，实验数据表明，相较于Aβ斑块，高度磷酸化的Tau蛋白在脑内的聚集情况与AD的神经元退行和认知功能衰减具有更好的相关性[5]。因此，借助核医学影像这种非侵入式的监测方法，实现脑中Tau蛋白含量的检测，对AD早期诊断以及探究疾病的发展情况都具有重要的医学价值。

正常生理条件下，Tau蛋白通过几种不同的氨基酸修饰翻译途径调控蛋白质的功能。例如利用氨基酸的磷酸化修饰调整微管蛋白的稳定性和聚合性，进而调节和稳定细胞骨架。然而，当氨基酸序列在修饰表达的过程中出现高度磷酸化的异常现象时，Tau蛋白的生物学功能紊乱或丧失，导致Tau蛋白从微管蛋白上脱落，在细胞内发生堆积。大量高度磷酸化的Tau蛋白在神经元细胞内的堆积使得氨基酸序列发生β-折叠，这种错误的折叠方式导致蛋白自身聚集形成两种不同的超微结构(双螺旋细丝(paired helical filaments, PHFs)和直线型纤维丝(straight filaments, SFs))，最终形成不溶性的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)[6]。神经元细胞中微管结构的破坏，造成了轴突转运受损和突触丢失等细胞生物功能损伤，进而发展成AD这种神经退行性疾病。目前，已报道的Tau蛋白显像剂同NFTs的结合方式大多是通过与β-折叠所形成的疏水空腔相互作用形成氢键[7]。值得注意的是，AD的另一个重要生物标记物Aβ斑块也含有相似的β-折叠疏水结构。与Aβ斑块不同， Tau蛋白主要存在于神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的内部[8-9]，且蛋白浓度远低于Aβ。

因此，相对于Aβ 类示踪剂的开发，构建靶向于Tau蛋白的显像剂应满足更严苛的要求。首先，示踪剂应当具有可靠的生物安全性；其次，相对分子质量必须足够小(≤ 600 Da) 且脂溶性适中(logP=0.9～3)，确保其能快速穿过血脑屏障和细胞膜，同细胞内的Tau蛋白结合；第三，示踪剂应当对Tau蛋白具有高亲和力和选择性，在脑内的非靶结合低，非特异性结合少；最后，示踪剂具有合适的药代动力学性质和生物体内较好的稳定性。可以快速从正常的大脑中清除，且无放射性代谢产物重新进入脑内干扰显像[10-12]。

1 Tau蛋白核医学显像剂的研究现状

随着核医学显像技术的发展，正电子发射断层扫描(positron emission tomography, PET)和单光子发射计算机断层扫描(single photo emission computed tomography, SPECT)显像的技术手段能够实现对疾病的早期检测、“实时”监测和治疗效果的评估。目前，已有多种靶向于Tau蛋白的分子探针被相继报道，其中一些Tau-PET显像剂已经进入临床探索阶段。此外，SPECT类的分子探针，由于其具有核素价格低廉、获取方便、药物制备过程简单等优势，近年来也受到广泛关注，具有选择性的Tau-SPECT探针被陆续发现。本文针对目前报道的PET/SPECT类Tau蛋白显像剂进行归纳和总结，分析这些分子探针的化学结构和生物性质之间的关系，期望对Tau蛋白显像剂的开发和临床应用提供新的思路。

1.1 PET类分子显像剂

从第一个Tau-PET显像剂[18F]FDDNP[13-14]被报道至今，关于靶向于脑内Tau蛋白的PET类显像剂的研发工作已开展二十多年。这些探针依据结构特点和发表时间先后被分为一代分子探针和二代分子探针。例如，以喹啉类衍生物、苯并咪唑-嘧啶衍生物和吡啶二烯-苯并噻唑类衍生物属于一代分子探针，而吡咯-吡啶类衍生物则属于二代分子探针。其中，部分生物性质优良且标记方法简单高效的分子探针已进入临床实验阶段(详见表1)。

表1 进入临床实验阶段的Tau-PET探针Table 1 Tau-PET tracers in clinical trials

续表1

1.1.1喹啉衍生物(THK系列) 日本东京大学的Yukitsuka Kudo团队通过高通量的药物筛选，发现喹啉类衍生物在体外神经病理学染色实验中能清晰的标记出脑切片上的Tau蛋白，并且具有良好的选择性。之后，为了进一步提高探针的选择性，对喹啉衍生物的结构进行了进一步的化学修饰，报道了一系列苯基喹啉类衍生物(THK系列)用于AD患者脑内Tau蛋白的检测。最早发表的化合物[18F]THK523[15]在人体PET的实验结果表明，它能够特异性结合AD患者脑中的Tau蛋白，然而较高的白质摄取为临床医生的图像读取和病情判断增添了困难。此外，更多的研究数据表明，探针在脑内还存在其他的非靶摄取并且稳定性较差，无法满足PET显像的要求[16]。值得注意的是，该研究利用同一个化合物做了多种不同Tau蛋白类型的亲和力测定，结果表明体外人工聚合的Tau蛋白由于其自身的环境和氨基酸序列的影响，并不能完全模拟人体内的Tau蛋白沉积(NFTs)，且亲和力数据存在较大的差别(人工聚合Tau蛋白亲和力为1.67 nmol/L，AD脑匀浆中的AD-PHF的亲和力为86.50 nmol/L)。因此，体外的亲和力测定结果只能作为筛选探针的参考指标，探针亲和力和选择性的评价仍需要更多元的评价手段还原更真实的蛋白环境。

该团队再次优化化学结构，同时对位于喹啉环上6位的烷基和苯环侧链的取代基进行修饰，得到了[18F]THK5105和[18F]THK5117[17]。高水溶性的氟丙醇侧链的引入极大提高了探针对Tau蛋白的选择性，同时N-甲氨基的引入也提高了探针对Tau的亲和力和选择性。人体PET显像结果表明，这两种探针均能有效区分AD患者与正常对照组，然而二者在脑内的清除速率过慢，使得探针的进一步临床应用受阻[18-19]。

为了进一步提高探针在脑内的药代动力学性质，用脂溶性更小的吡啶环替换THK5317中的苯环得到了THK5351[20]。又对氟丙醇侧链进行手性碳原子的拆分，通过实验发现，S构型的THK5351药代动力学性质优良，脑白质的非特异性摄取低，显像信噪比好，更有利于临床诊断的应用[21]。

大量的临床PET图像显示，THK系列探针都与脑内纹状体中的单胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)存在较高的非靶结合，尤其是单胺氧化酶B (MAO-B)。MAO-B在脑内的含量随年龄增长而增多，而AD的诊断大多是针对65岁以上的老年人，因此该系列探针过高的非靶结合严重影响了AD诊断的准确率[22-23]。

1.1.22-苯基喹喔啉衍生物([18F]S-16) 2017年，北京师范大学崔孟超团队报道了3对具有光学异构的18F标记的2-苯基喹喔啉衍生物[24]。该工作在之前该课题组报道的2-苯基喹喔啉骨架结构[25]的侧链上引入具有手性羟基的氟丙醇侧链，使探针在识别β-折叠的基础上增加水溶性，从而提高探针对Tau蛋白的亲和力和选择性，改善体内药代动力学性质。通过测定稳定的氟代化合物与3个特异性结合位点的竞争性配体([3H]THK523,[3H]T807和[3H]PIB)在AD人脑匀浆中的放射性竞争结合实验，定量说明了探针的亲和力，其中S-16表现出了对Tau蛋白的高亲和力以及选择性(Ki=10.3 nmol/L，选择性=34.6倍)。AD人脑切片的放射自显影结果表明，[18F]S-16可以特异性的与转基因小鼠(rTg4510)和AD患者脑切片上的NFTs结合，并且得到了探针自身的体外荧光染色和AT8抗体的免疫荧光染色的结果确认。小鼠体内的药代动力学研究表明，[18F]S-16在正常小鼠脑中稳定且无放射性的代谢产物干扰脑部放射性信号采集，能够快速穿透BBB并且从正常小鼠脑内快速清除(brain2 min=(10.95±1.29)%ID/g, brain2 min/brain60 min=6.5)，同时在小鼠体内不存在脱氟现象。经过前期系统的评价，[18F]S-16满足作为Tau-PET显像剂的需求。目前，[18F]S-16在天津医科大学总医院参与完成以“A/T/N”为研究纲领的核医学显像检查，与[18F]FDG和[11C]PIB在同一条件下对患者进行PET-CT显像，综合诊断患者的病情。大量的采集图像表明，[18F]S-16能够与患者脑中的Tau蛋白特异性结合，并且同[18F]FDG和[11C]PIB的核医学影像信息相对应，有效实现了Tau相关疾病患者与健康对照组的区分。同时，该探针通过了中国人民解放军总医院第一医学中心伦理委员会的批准，进入临床I期探索实验阶段(ClinicalTrials.gov ID: NCT03620552)。

此外，该系列探针荧光量子产率高，对Tau蛋白的特异性和选择性好，作为一种商业化荧光染料替代免疫荧光染色方法，用于体外高灵敏度Tau蛋白检测。

1.1.3咔唑、苯并咪唑类多环衍生物(T系列、[18F]RO-948和[18F]PI-2620) Kolb团队利用体外病理学染色或放射性自显影的方法对800个化合物进行筛选，发现多环类的化合物咔唑、苯并咪唑衍生物对Tau蛋白具有较高的亲和力和选择性。其中，化合物[18F]T807[26]和[18F]T808[27]是两个有潜力的Tau-PET显像剂。体外饱和结合实验说明，探针对AD人脑匀浆中的Tau蛋白有良好的亲和力和选择性。此外，探针的初始脑摄取值较高，药代动力学性质良好，满足PET显像需求。但进一步的研究结果表明，[18F]T808在体内存在严重的脱氟现象，无法进行临床探究[28-29]。而大量的临床结果表明，[18F]T807能够清晰的标记出AD患者脑内的神经纤维缠结，有效区分AD患者和正常对照组。因此，2020年5月28日，[18F]T807被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准上市，成为了第一个可用于临床诊断的Tau蛋白PET类显像剂。

然而，临床数据表明[18F]T807也存在较为严重的非靶结合，主要是同位于纹状体内的MAO-B结合。此外，在脉络丛和黑质区域有明显的非特异性结合，可能是作用于脂褐素等[23, 30-31]。因此，Roche公司在T807的结构基础上，报道了一系列多环类化合物作为有潜力的Tau-PET显像剂。通过化学修饰将N原子引入到核心芳环结构中，降低分子脂溶性，从而提高探针对Tau蛋白的选择性，减少非特异性结合。其中，[18F]RO-948表现出良好的生物学特性和药代动力学性质。初步的临床前实验表明，探针可以迅速穿过灵长类动物的BBB (SUV=1.1～2.0)，并从正常脑组织中快速代谢。在人体的PET显像中，探针可以特异性地与AD患者脑中的Tau蛋白结合，能够有效区分正常对照组和AD患者。此外，对图像数据进行分析，未观察到非靶结合。更多的临床试验仍在进行中，已有的临床数据表明，[18F]RO-948非常有应用前景[32]。

类似地，[18F]PI-2620也是在T807的结构基础上进行化学修饰。根据报道，该探针可以识别不同Tau相关疾病中对应的4R和3R结构，例如进行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy, PSP)中的4R结构和皮克病(Pick disease)中的3R结构。此外，临床实验数据显示，[18F]PI-2620在脑内与单胺氧化酶不存在非靶结合。更详细的临床评价仍在进行中[33]。

1.1.4苯并噻唑类衍生物([11C]PBB3) 2013年，日本Makoto Higuchi团队利用体外荧光染色实验筛选发现化合物的骨架长度和分子脂溶性会影响探针对Tau蛋白的选择性。他们报道了一系列具有反式丁二烯桥键的苯并噻唑类衍生物(phenyl/pyridinyl-butadienyl-benzothiazole/benzothiazolium)PBBs[34]。该类化合物较长的分子骨架结构能够提高探针对Tau蛋白的亲和力和选择性，其中PBB3具有高亲和力(Kd=2.55 nmol/L)和良好的选择性(50倍)。但是正如之前提到的一样，[11C]PBB3的放射性自显影结果表明，探针与人脑切片上的Aβ斑块和NFTs均有结合。PET显像结果显示，与[11C]PIB图像不同，[11C]PBB3在AD患者脑部的海马区有明显的放射性聚集，且浓集程度与AD临床症状严重程度有很好的相关性。然而，[11C]PBB3存在明显的光致异构化现象，探针的标记过程要求严格避光，此外11C核素的物理半衰期短，限制了进一步的临床应用[21]。

为了克服11C短半衰期的应用局限，将18F核素引入PBB3的分子结构上，报道了[18F]PBB3作为PET类Tau蛋白显像剂的生物应用价值。目前，新旭医药与上海华山医院展开合作项目，共同推进[18F]APN-1607([18F]PBB3)的临床阶段的探索。

1.1.5氮杂吲哚类衍生物([18F]MK6240) 2016年，Merck公司建立一套完整的体外筛选实验方法，通过高通量的构效关系筛选，并优化化合物结构，最终得到高亲和力和选择性的Tau-PET探针[18F]MK6240[35]。人体的PET显像结果表明，[18F]MK6240可以有效区分AD患者、轻度认知障碍患者和正常对照组。此外，脑内性质稳定，无放射性代谢物产生，体内药代动力学性质良好，并且没有观察到包括Aβ和MAO-B在内的非靶区放射性信号浓集[36]。

1.1.61,5-萘啶胺衍生物([18F]JNJ311) Janssen药物公司利用高通量筛选的方式，报道了全新的基于1,5-萘啶胺类衍生物作为高选择性的Tau蛋白显像剂[37]。通过构效关系分析，最终确定Tau蛋白亲和力和选择性最好的化合物结构上吡啶基氮的位置、取代基的位置以及氟原子的位置，筛选得到了探针[18F]JNJ311。随后，进行了一系列小鼠、大鼠及恒河猴的临床前评估[38]。实验结果表明,[18F]JNJ311具有良好初始脑摄取和药代动力学性质，并且体内代谢稳定，血浆中的放射性代谢产物无法再次穿透BBB干扰脑中放射性信号采集。此外，脑部的PET图像表明探针无非靶结合。综上，[18F]JNJ311完全满足选择性的Tau-PET探针的要求，是一种有潜力的PET类显像剂。

1.2 SPECT类分子显像剂

相较于Tau-PET显像剂，SPECT类显像剂研发相对滞后，研发时间较短，临床应用方面仍需克服许多障碍。目前为止，报道的化合物类型非常有限，标记核素也主要集中于I-125这种物理半衰期较长的核素(表2)。

表2 几种典型的Tau-SPECT探针Table 2 Several Tau-SPECT tracers

1.2.1苯并噻唑衍生物 大量研究结果表明，以苯并噻唑为骨架结构的分子探针对β-折叠有很好的识别作用，但AD患者脑中Aβ斑块也具有和Tau蛋白相似的β-折叠。Nicolette S.Honson团队通过体外荧光竞争结合实验(同Th-S发生竞争性抑制荧光强度)，从7万多个分子结构中筛选出苯基二氮烯基苯并噻唑(phenyldiazenyl benzothiazole, PDB)类衍生物，该类衍生物对Tau蛋白具有较高的亲和力和一定的选择性[39]。

2011年，日本京都大学Hideo Saji团队对PDB结构进行修饰，并进行I-125标记得到化合物[125I]2.1，以期望能够作为一种Tau蛋白SPECT显像剂用于AD的早期诊断[40]。体外放射性自显影结果表明，[125I]2.1能够特异性地与AD患者脑切片上的NFTs结合，且与Tau蛋白的免疫组化结果匹配，但同时Aβ的免疫组化结果也表明探针可以结合AD患者脑切片上的Aβ斑块。之后，在正常小鼠体内生物分布实验中，虽然探针[125I]2.1表现出了良好的初始脑摄取值(0.94% ID/g)，但60 min时脑摄取值升高，说明其放射性代谢产物在正常脑中存在严重滞留或随血液循环再次进入脑内，这对临床应用非常不利，无法从影像学图像上区分病患和正常对照组。

1.2.2苯并咪唑衍生物 由于PDB类衍生物脂溶性较高，其体内的药代动力学性质不尽如人意。因此，Hideo Saji团队又报道了一系列苯并咪唑类化合物，通过将苯并噻唑替换成苯并咪唑来降低化合物的脂溶性，同时，去掉重氮结构减少化合物的生物毒性，筛选得到了化合物[125I]SBIM-3[41]。尽管化合物的初始脑摄取值和脑部的药代动力学性质都有了明显改善，但探针对Tau蛋白的亲和力和选择性大大降低，阻碍了探针的进一步应用。

2015年，Hideo Saji团队再次修饰了苯并咪唑的骨架结构，筛选得到了性质更为优良的探针[125I]2.2[42]。去掉分子结构中的N,N-二甲氨基部分，以提高分子探针对Aβ斑块的选择性。放射性自显影结果和免疫组织化学染色结果表明，[125I]2.2在颞叶有明显的放射性沉积，与Tau蛋白在AD患者脑内的沉积情况相对应，然而在Aβ蛋白沉积的对应位置，也观察到了大量的放射性信号。这一结果表明，尽管化学结构的修饰改善了探针的亲和力，但较差的选择性仍是该类探针急需解决的问题。[125I]2.2表现出了良好的药代动力学性质(2 min脑摄取值为3.69%ID/g，60 min脑摄取值为0.06%ID/g)。此外，该系列化合物存在较严重的光异构化问题，这使得探针难以应用推广。

1.2.3硫代乙内酰脲(thiohydantoin, TH)衍生物 2011年，Hideo Saji团队对硫代乙内酰脲(thiohydantoin, TH)结构进行化学修饰，报道了[125I]TH2，该探针表现出对Tau蛋白较高的亲和力(Ki=64 nmol/L)和一定的选择性(7.3倍)[43]。并且神经病理学染色表明，该探针可以特异性结合AD患者脑切片上海马部分的NFTs，体外放射性自显影和免疫染色结果也进一步表明了其对组织切片上NFTs的亲和力。但和PDB衍生物的问题相同，较高的分子脂溶性使得探针的药代动力学性质不尽如人意。此外，探针的亲和力和选择性也需要进一步优化。

1.2.42-苯基喹喔啉衍生物 2019年，北京师范大学崔孟超团队报道了一系列99mTc标记的以亚氨基二乙酸二乙酯(diethyl iminodiacetate, IDA)为螯合配体的2-苯基喹喔啉类Tau蛋白分子探针用于AD的早期诊断[44]。其中探针[99mTc]2.3展现出与Tau蛋白的高亲和力(Kd=(59.95±2.56) nmol/L)，以及对Aβ聚集体的选择性(20.3倍)。体外放射性自显影结果进一步证明，探针能够特异性与转基因(Tau)小鼠和AD患者脑切片上的NFTs结合且对Aβ有很好的选择性，该结果也得到了Gallyas-Braak染色的证实。在正常小鼠的体内生物分布研究表明，尽管[99mTc]2.3可以穿过BBB并且快速从非靶脑区清除，但是较低的初始进脑量使得探针不具有进一步生物应用的价值。综上，喹喔啉衍生物的骨架结构使得分子探针对Tau蛋白具有良好的亲和力和选择性，但99mTc标记探针的穿透BBB能力和体内药代动力学性质成为这一类SPECT显像剂开发的重要瓶颈。99mTc标记配体类型的选择以及相对分子质量大小的设计可能是解决这个问题的关键。

2 总结与展望

2018年，美国老龄化研究所和阿尔茨海默病协会共同发布的以生物标志物A/T/N为研究框架的诊断指南，为AD的临床诊断及病理学发展研究带来了新的契机[45]。此时，[18F]T807作为首个进入临床诊断的Tau蛋白显像剂为AD的确诊提供了重要参照。然而，临床结果显示明显的非靶结合干扰了临床医生对于结果的准确判断，因此开发高亲和力和选择性的Tau蛋白显像剂成为了亟待解决的关键问题。在未来的5～10年，新型Tau蛋白显像剂的研发及临床实验的开展尤为重要。

对于PET类Tau探针来说，发展时间相对较长，分子库结构类型丰富，体内生物学性质良好，但仍面临许多棘手的问题。一代Tau探针临床数据显示，严重的非靶结合(如MAO, Aβ等)是临床诊断应用的瓶颈，但能够筛选出对Tau蛋白具有高亲和力的分子结构，进一步的化学结构修饰也是突破应用瓶颈的方法。二代探针在提高亲和力和选择性的同时，有效降低了非靶结合，提高了显像剂的药代动力学性质和体内稳定性。但由于研发时间较短，许多临床实验数据不足，仍需要大量的横向和纵向研究来进一步探究临床诊断的可靠性。

此外，目前Tau-SPECT显像剂的开发相对比较滞后，但是SPECT类核素制备简单、方便且价格低廉。因此开发特异性好选择性高的Tau蛋白显像剂将成为热点，同时SPECT类显像剂也面临诸多挑战，例如提高初始脑摄取值，改善分子药代动力学性质等。

在新型Tau选择性探针的开发过程中，化合物的筛选要综合多种生物评价手段，注重数据结果的综合考察。此外，Tau蛋白显像剂的开发所面临的问题主要是体外的蛋白实验并不能很好的模拟患者脑内的真实情况，且病理性的Tau蛋白在脑内的含量较低，这对探针的亲和力和选择性都有很高的要求。

还有一个值得注意的问题是，Tau相关的疾病还包括很多种，由于病理状态下Tau蛋白的表达表型不同，使这些疾病表现了不同的临床症状。脑内的病理状态Tau蛋白除了神经纤维缠结的形态外，还存在ghost tangles(GTs)和neuritic plaques(NPs)等形态特点[46]。这要求设计显像剂时，还需考虑不同病理学状态下Tau蛋白的类型(3R, 4R)，Tau蛋白沉积形态(NFTs, NPs, GTs)，细胞环境状态(神经细胞，胶质细胞)等因素[47]。