不同品种啤酒花对啤酒特征香气物质的影响

王 茜，孙娇娇，侯 静，彭丹丹，赵 育

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710119）

0 引言

啤酒花，是桑科葎草属多年生草质蔓生藤本植物[1]，它可以赋予啤酒特征风味，影响啤酒的质量和口味，被誉为“啤酒的灵魂”[2]。啤酒花化学组分复杂，其中啤酒花精油、苦味酸和啤酒花多酚是国内外研究人员关注的重点，它们在啤酒生产过程中具有重要作用[3]，赋予啤酒特征风味的主要是啤酒花精油中的挥发性成分，啤酒花精油中也含有少量不易挥发的含硫化合物[4]；苦味酸中的异α - 酸、β - 酸的氧化物可以使啤酒具有爽口的苦味；啤酒花多酚可以提高啤酒的抗氧化能力，促进啤酒杀口感的形成。

在20 世纪60 年代就有国外研究人员对啤酒通过萃取浓缩等处理方法来对啤酒香味物质进行定性和半定量测定[5]。Inui T 等人[6]首次分析测定了啤酒花精油成分，确定了近250 种成分。近年来，Heinlein A 等人[7]分析了31 种啤酒花品种，确定了啤酒花香气物质中的11 种重要成分。国内对于啤酒花的研究起步较晚，王憬等人[8]建立HS-SPME- GC-MS 方法分析啤酒中啤酒花香气成分，从啤酒中准确定量了里哪醇、香叶醇、香茅醇、橙花叔醇、乙酸香叶酯、乙酸香茅酯、香叶酸甲酯这7 种香气成分，并确认了里哪醇可以作为啤酒花香组分的标志性物质。王露等人[9]分析确定了影响啤酒香气的里哪醇、香茅醇、香叶醇和橙花叔醇这4 种关键性萜烯醇，并初步揭示了啤酒酿造中香气物质的变化规律。到目前为止，学者普遍认为啤酒香气是由里哪醇、香叶醇、香茅醇等协同发挥作用的。然而，目前尚无对用不同啤酒花酿造啤酒中香气物质的变化规律的比较及成品酒中风味物质的比较的研究。

马格努门、萨兹、卡斯卡特和青岛大花是4 种国内啤酒厂常用的啤酒花。试验以上述4 种啤酒花进行啤酒酿造试验，采用HS-SPME-GC-MS 法测定啤酒特征香气物质在啤酒发酵过程中的演变规律，探究这4 种不同啤酒花酿造的啤酒特征香气物质的差异及啤酒花对啤酒理化指标和感官的影响，以期为啤酒生产中啤酒花对啤酒特征香气物质和品质的影响奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

90 型马格努门颗粒啤酒花、90 型萨兹颗粒啤酒花、90 型卡斯卡特颗粒啤酒花、90 型青岛大花颗粒啤酒花，新疆方睿啤酒原料制品有限公司提供；皮尔森基础澳麦芽，永顺泰麦芽有限公司提供；安琪啤酒活性干酵母CN36，安琪酵母股份有限公司提供。

主要试剂：香气物质标准品（色谱级），美国Sigma 公司提供；乙醇（色谱级）、正丁醇（色谱级），天津市科密欧化学试剂有限公司提供；氯化钠、盐酸、异辛烷，天津市天力化学试剂有限公司提供。

1.2 主要仪器

7890B 型气相色谱仪、7000C 型质谱仪，安捷伦科技有限公司产品；顶空固相微萃取装置，意大利HTA 公司产品；JHW 型啤酒花粉碎机，北京蓝伯斯科技有限公司产品；JMF-5A 型麦芽粉碎机，山东双佳农牧机械科技有限公司产品；HH-S4 型数显恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司产品；雷磁Ph-SJ-4A 型pH 计，上海久世环保科技有限公司产品；TH-200BQ 型数控超声波清洗机，济宁天华超声电子仪器有限公司产品；Anke TGL-16G 型飞鸽离心机，上海安亭科学仪器厂产品；T6 型新世纪紫外- 可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；GC-2010PLUS AF 230V 型岛津气相色谱仪，岛津企业管理中国有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 啤酒酿造工艺流程[10-11]

麦芽粉碎→麦芽汁糖化→麦芽汁过滤→麦芽汁煮沸→麦芽汁澄清沉淀→麦芽汁冷却→接入啤酒花→接入酵母菌→发酵→成品。

以不添加啤酒花的啤酒为空白对照组，添加4 种不同品种啤酒花的啤酒为试验组，试验共酿造5 种啤酒。此酿造工艺中，每种啤酒均将1 kg 麦芽采用增湿粉碎法粉碎。麦芽汁糖化采用浸出式糖化法，麦芽与水初始的质量比为1∶5，糖化分为4 个阶段：第一阶段，粉碎的麦芽在35～40 ℃水温下保温30 min，促进麦芽软化和酶的活化；第二阶段，升温至52 ℃，保温20 min，进行蛋白质分解；第三阶段，搅拌升温至65 ℃，保温1 h，使α - 淀粉酶开始水解；第四阶段，升温至78 ℃，结束糖化。发酵分为2 个阶段，第一阶段温度在12 ℃，当麦芽汁浓度降到4.5-5.0 °P 后，封罐保压发酵，发酵时间为7 d；之后逐步降温至4 ℃，将酒液进行低温贮藏发酵，此阶段发酵时间为14 d。各组啤酒中啤酒花添加量均为0.5 g/L。

1.3.2 啤酒花及酒样中啤酒花特征物质的提取与检测[12]

（1） 顶空固相微萃取。采用100 μm PDMS/DVB复合萃取头对颗粒啤酒花和酒样中的香味物质进行提取和富集。通过将待测具有挥发性的香气化合物固定到聚乙烯纤维上进行提取和富集，从而获取待测样品中的挥发性的香味物质。

样品前处理：啤酒酒样冷却至4 ℃并保持2 h，使挥发性啤酒花衍生的香气成分的损失最小化。将冷啤酒倒入250 mL 锥形烧瓶中并通过超声脱气直至二氧化碳逸出不明显。啤酒花颗粒于冷藏4 ℃冰箱，使用前JHW 型啤酒花粉碎机粉碎，现用现制。

将5 mL 等份的脱气啤酒样品或0.5 g 啤酒花样品移到含有2 g NaCl 和0.1 mL 4 - 甲基- 2 - 戊醇（内标浓度5.0 mg/L） 的20 mL 玻璃小瓶中。然后，将样品瓶用PTFE 涂覆的SPME 特异性隔膜磁体盖密封并在分析中保存，直至分析。

将样品瓶置于70 ℃加热器中平衡30 min 后，将老化的萃取头插入密封的样品瓶中，顶空萃取40 min，然后在气相色谱进样口230 ℃解析3 min，采用GC-MS 分析其挥发性成分。

（2） 气相色谱- 质谱分析。①GC 条件：石英毛细管色谱柱HP-5MS（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；起始温度40 ℃，保留时间2.5 min，以5 ℃/min 升至240 ℃，再以10 ℃/min 升至250 ℃并保留7.5 min；不分流进样，载气为He，流速1.0 mL/min。②MS 条件：电离方式EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，进样口温度230 ℃，传输线温度250 ℃，质量范围40～500 amu。

1.3.3 啤酒理化指标测定

（1） 色度的测定[13]。啤酒色度采用紫外- 可见分光光度法测定。酒样以转速4 000 r/min 离心7 min，将经离心后的啤酒样品倒入10 mm 玻璃比色皿中，用蒸馏水调整零点，于波长430 nm 处测定吸光度。色度计算公式可表示如下:

式中：S——样品的色度，EBC；

A430——样品于波长430 nm 处的吸光度；

25——换算系数。

（2） pH 值的测定。pH 值采用ST5000 型pH 计测定，测定前待测酒样需除气。

（3） 苦味值的测定[14]。苦味值采用紫外分光光度法测定。取除气后的酒样50 mL，加入浓度为3 mol/L的盐酸溶液5 mL，充分振荡使其混合均匀，而后加入100 mL 异辛烷，再置于振荡器上振荡5 min，静置5 min 分层后取上层乳状液体，以转速3 500 r/min离心15 min，取上清液于1 cm 石英皿中，用异辛烷调整零点，于波长275 nm 处测定吸光度。苦味值计算公式可如下表示：

苦味值（IBU） = A275×50.

式中：A275——样品波长275 nm 处的吸光度；

50——换算系数。

（4） 酒精度的测定[15]。酒精度采用气相色谱法测定，气相色谱条件根据实验室现有方法略作改进。将酒样稀释10 倍后进样测定，以正丁醇（色谱级）作为溶剂。气相色谱仪器为配FID 检测器的GC-2010PLUS AF 230V 型岛津气相色谱仪。气相色谱条件：HP-INNOWAX 毛细管柱型色谱柱（30.0 m×0.32 mm×0.25 μm），柱温采用程序升温，60 ℃平衡3 min，10 ℃/min 升温至120 ℃，平衡1 min；气化室温度210 ℃，检测器温度210 ℃，分流比28∶1；载气（N2），流速80 mL/min；流量程序：氢气流量40 mL/min；空气流量400 mL/min，尾吹30 mL/min；进样1 μL，测定方法：外标法。

（5） 原麦芽汁浓度的测定[16]。依据GB/T 4928—2008 的方法，测出啤酒样品的实际浓度，并以如下公式计算出啤酒样品的原麦芽汁浓度。

式中：X——原麦汁浓度，°P；

A——酒精度含量质量分数，%；

E——实际浓度质量分数，%。

1.3.4 感官鉴评[17-18]

30 位经过感官鉴评训练的学生对5 种存储于4 ℃冰箱里的成品啤酒进行感官品评。

啤酒感官评分标准见表1。

表1 啤酒感官评分标准

2 结果与分析

2.1 不同啤酒花特征香气组分对比

不同品种啤酒花特征香气物质对比见表2。

表2 不同品种啤酒花特征香气物质对比

对比同一啤酒花中的香气成分可以看出，马格努门和青岛大花中香茅醇含量最高，而萨兹和卡斯卡特中香叶醇含量最高；对比不同品种啤酒花中的香气成分可以看出，里哪醇、橙花叔醇、乙酸香叶酯和乙酸香茅酯含量最高的为马格努门，香叶醇含量最高的为萨兹，香茅醇含量最高的为青岛大花。

2.2 特征香气物质在啤酒发酵过程中演变规律

啤酒酿造过程中特征物质的含量变化见图1。

图1 啤酒酿造过程中特征物质的含量变化

每隔2 d 检测啤酒在0～8 d 发酵过程中特征香气物质的含量，并以发酵20 d 的啤酒作为成品检测。

由图1 可知，马格努门成品酒中里哪醇、香茅醇、乙酸香茅酯和香叶酸甲酯含量最高，分别为1.44，1.18，1.87，0.73 μg/L，因为马格努门啤酒花中的特征香气物质含量较高；萨兹啤酒、卡斯卡特啤酒和青岛大花啤酒的特征香气物质中含量最大的分别是香叶醇、乙酸香叶酯和橙花叔醇，其含量分别为5.97，0.31，2.43 μg/L；未添加啤酒花的空白组啤酒在发酵过程中没有检测到里哪醇、香叶醇、香茅醇和橙花叔醇等单萜醇类化合物，表明啤酒中单萜醇类的来源是啤酒花，酵母菌在发酵过程中不产生单萜醇类，且啤酒花可以给啤酒带来更多的香叶酸甲酯、乙酸香茅酯、乙酸香叶酯等萜烯酯类化合物以增强啤酒的风味。

由图1（a） 可知，发酵时间在0～4 d 时，青岛大花中橙花叔醇含量的上升较快，幅度超过其他啤酒花；4 d 之后橙花醇的含量趋于平稳，成品啤酒中橙花叔醇含量增长率为58.06%。由图1（b） 可知，4 种添加啤酒花的啤酒中里哪醇含量在发酵过程中一直呈下降趋势，成品啤酒中马格努门的减少率达到了42.48%，试验结果与Hanke S 等人[19]研究里哪醇在啤酒中减少率为50%～100%的结果较为接近。由图1（c） 可知，当发酵时间为0～2 d 时，添加啤酒花的啤酒中香茅醇的含量快速上升；发酵2 d 后啤酒中的香茅醇开始下降，这可能是由于在发酵过程中里哪醇通过生物化学反应部分转化为香茅醇[20]。由图1（d） 可知，当发酵时间为0～6 d 时，添加啤酒花的啤酒中香叶醇含量快速下降；发酵时间为6～8 d时，啤酒中香叶醇的含量增加为2.0 μg/L，之后啤酒中香叶醇的含量变化不明显，成品酒中香叶醇下降率为76.92%。由图1（e） 和图1（f） 可知，5 种啤酒在发酵过程中香叶酸甲酯和乙酸香茅酯含量均呈现出先上升后下降的趋势，发酵4 d 时卡斯卡特中香叶酸甲酯含量最高，发酵6 d 时马格努门中乙酸香茅酯含量最高，成品啤酒中马格努门的香叶酸甲酯和乙酸香茅酯含量最高。由图1（g） 可知，5 种啤酒中的乙酸香叶酯整体呈现缓慢上升的趋势，成品啤酒中卡斯卡特啤酒的乙酸香叶酯含量最高。

特征香气物质方差分析及统计量见表3。

表3 特征香气物质方差分析及统计量

对成品啤酒的特征香气物质进行差异性分析，不同啤酒花酿造的啤酒中里哪醇、香叶醇、乙酸香叶酯和乙酸香茅酯差异显著，橙花叔醇、香叶酸甲酯和香茅醇不存在显著差异。乙酸香叶酯和乙酸香茅酯的感官阈值高于里哪醇和香叶醇的感官阈值，在同等含量水平下酯类的香气更难被消费者感知到，因此里哪醇和香叶醇对啤酒特征香气的贡献大于乙酸香叶酯和乙酸香茅酯的贡献，在5 组啤酒样品中对啤酒特征香气贡献最大的是里哪醇，其次是香叶醇。

2.3 啤酒中啤酒花特征香气物质组分分析

对5 组啤酒的7 种特征香气物质进行主成分分析[21]，得到主成分的特征值和贡献率。按照提取主成分的个数一般要求其累计方差贡献率超过75%的原则，存在2 个特征值> 1 的主成分，累计贡献率达92.099%。

主成分的特征值及其贡献率见表4，主成分载荷矩阵见表5。

表4 主成分的特征值及其贡献率

表5 主成分载荷矩阵

主成分因子1 中主要有里哪醇、香叶醇、香茅醇、橙花叔醇和乙酸香叶酯，其相关系数分别为0.981，0.899，0.970，0.968，0.791，在主成分1 中起正相关作用，表明里哪醇是啤酒香气中一种重要物质，且可以作为一种标志性化合物来评价啤酒香气[22]。主成分因子2 中主要有乙酸香茅酯和香叶酸甲酯，其相关系数分别为0.813 和0.694，在主成分2中起正相关作用。

5 种啤酒的主成分散点图见图2。

图2 5 种啤酒的主成分散点图

青岛大花落在第一象限，卡斯卡特和马格努门落在第二象限，空白组落在第三象限，萨兹落在第四象限。5 组啤酒落点相距较远，表明5 组啤酒的香气物质含量和风味特征存在差异。

2.4 成品啤酒感官品评及理化指标分析

根据表1 啤酒感官评分标准对5 种成品啤酒进行感官鉴评。

不同品种啤酒花酿造啤酒感官评分雷达图见图3。

图3 不同品种啤酒花酿造啤酒感官评分雷达图

5 组啤酒的外观色泽无明显差异，酒体均呈淡黄色，清澈透亮，无浑浊感；添加啤酒花的啤酒泡沫特性明显优于不加啤酒花的啤酒。感官鉴评结果与以上GC-MS 测定的啤酒花中的特征香气物质结果相符。马格努门带有较浓的玫瑰花香和苹果香味，酯香浓郁、苦味充足、泡沫细腻、口感协调柔和、杀口感适中，这是因为马格努门中含有大量可以赋予啤酒花香和水果香的里哪醇、香茅醇、乙酸香茅酯和香叶酸甲酯。萨兹啤酒有一种淡淡的花香，酒花香和酯香融合均匀协调，苦味比较适中，口感平衡，清爽可口，这是因为萨兹含有较多的香叶醇。卡斯卡特啤酒因其乙酸香叶酯含量较高表现出玫瑰香和丁香味，苦味一般，杀口感略微不足。青岛大花啤酒具有药草香和微异杂味，啤酒花香和酯香表现一般，苦味稍显粗糙、口感偏清爽。不添加啤酒花的空白组啤酒不存在里哪醇、香叶醇等单萜醇和酯类，因此口感寡淡。

不同品种啤酒花酿造啤酒理化指标分析见表6。

表6 不同品种啤酒花酿造啤酒理化指标分析

对啤酒成品进行理化指标分析，不同啤酒的原麦芽汁浓度、酒精度、色度没有显著性差异，说明啤酒花种类对啤酒的原麦芽汁浓度、酒精度、色度无明显影响。苦味值存在明显差异，原因是不同品种啤酒花所含α - 酸含量不同，在发酵过程中异构化程度也可能不相同，最终导致成品啤酒中的苦味物质含量有差异[23-24]。

3 结论

以皮尔森基础澳麦芽为原料，分别添加马格努门、萨兹、卡斯卡特、青岛大花4 种单一啤酒花酿造拉格啤酒，测定里哪醇、香叶醇、香茅醇、橙花叔醇、乙酸香叶酯、乙酸香茅酯、香叶酸甲酯等7 种特征香味物质在啤酒发酵过程的变化量，里哪醇和香叶醇的含量在成品啤酒中显著下降，马格努门中里哪醇和卡斯卡特中香叶醇含量下降最多，下降率分别为42.48%和76.92%；添加啤酒花的啤酒在发酵过程中香茅醇、橙花叔醇、乙酸香叶酯、乙酸香茅酯、香叶酸甲酯的含量总体上呈上升趋势。在添加啤酒花的啤酒中检测到单萜醇类且萜烯酯类含量较未添加啤酒花时明显增加，表明啤酒中单萜醇类的来源是啤酒花。在对啤酒香气物质进行主成分分析时，确定了里哪醇是啤酒中一种重要的香气物质，在对成品啤酒进行理化指标测定时发现啤酒花会对啤酒的苦味值产生较大影响。研究结果为啤酒生产中啤酒花对啤酒特征香气物质和品质的影响奠定了理论基础，为啤酒厂对啤酒花的选择提供一定的参考依据和理论支持，具有十分重要的实际意义。