miR-365-3p靶向PTEN调控骨关节软骨细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭

安贵峰 曾艳 陈拥

(沈阳医学院附属中心医院骨外科，辽宁 沈阳 110024)

骨关节炎是一类关节边缘骨骼变化、软骨发生纤维化、溃疡及脱落等现象的关节疾病，多发于中老年人群，并且女性多于男性，严重影响患者生活质量〔1〕。骨关节炎的发病机制较为复杂，认为其发病原因与软骨细胞在细胞外基质中的异常增殖、迁移等导致的关节软骨愈合、修复能力异常密切相关〔2〕。微小RNA(miRNA)是一类小分子单链非编码RNA，其可通过靶向靶基因的表达参与调控细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为〔3〕。研究显示，miRNA参与骨关节炎的发生和发展〔4〕。有报道称，miR-365在膝骨关节炎患者血浆和关节滑液中表达上调，可能参与了膝骨关节炎的病理过程〔5〕；miR-365在原发性骨关节炎患者和创伤性骨关节炎患者软骨中表达升高，抑制miR-365表达能够下调白细胞介素(IL)-1β诱导的基质金属蛋白酶(MMP)-13和X型胶原(Col X)的基因表达，miR-365可能是预防和治疗骨关节炎的潜在靶点〔6〕。本研究主要探讨miR-365对骨关节软骨细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1组织样本来源 选取2017年10月至2018年12月沈阳医学院附属中心医院关节与骨髓肿瘤病区接受治疗的60例骨关节炎患者作为骨关节炎组。诊断标准参照2007年中华医学会骨科学分会《骨关节炎诊治指南》〔7〕。其中男19例，女41例，年龄62～75〔平均(69.23±5.21)〕岁。另选取60例因股骨颈骨折而行全髋关节置换术的患者作为正常对照组，其中男22例，女38例，年龄60～76〔平均(68.59±5.67)〕岁。两组年龄、性别等差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。两组关节软骨标本在游离后无菌状态下置于装有平衡液的无菌标准袋，送往实验室处理。

1.2实验试剂 miRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和聚合酶链反应(PCR)试剂盒(Takara公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；DMEM培养基、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒、Annexin V-FITC/PI试剂盒(北京索莱宝)；LipofectamineTM2000试剂盒(美国 Invitrogen公司)；miR-365-3p模拟物(mimics)和抑制剂(anti-miR-365-3p)、模拟对照(miR-NC)和抑制剂阴性序列(anti-miR-NC)、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)过表达载体(pcDNA3.1-PTEN)及空载体(pcDNA3.1)(上海生工)；Western印迹实验相关抗体(武汉博士德公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)。

1.3方法

1.3.1qRT-PCR检测miR-365-3p表达 使用miRNA提取试剂盒提取软骨组织中总RNA，逆转录为cDNA后，行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环。 2-△△Ct法计算miR-365-3p相对U6的表达量。

1.3.2原代人骨关节软骨细胞分离和培养 参照文献方法分离培养人骨关节软骨细胞〔8〕。将手术取下的软骨标本用生理盐水冲洗，去除残留的血液和组织液，于1 h内无菌转移至超净工作台内，使用含1%双抗(青霉素100 U/ml和链霉素100 μg/ml)并预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次。用手术刀片薄层削取关节中心区域的软骨薄片，用预冷PBS清洗3次，并将其切成约1 mm3碎块。PBS清洗3次后，加入0.25%胰蛋白酶消化液，37℃培养箱中消化30 min。吸弃消化液，加入0.2%Ⅱ型胶原酶消化16 h。1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入DMEM培养基再次洗涤细胞。1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，200目滤网过滤后，将细胞以1×105/ml密度接种于细胞培养瓶中，置于CO2培养箱中培养。

1.3.3细胞转染 将对数期软骨细胞以5.0×105个/孔接种于6孔板中，培养24 h后，弃培养基，用LipofectamineTM2000试剂盒分别转染miR-365-3p mimics(miR-365-3p组)、miR-NC(miR-NC组)、anti-miR-365-3p(anti-miR-365-3p组)、anti-miR-NC(anti-miR-NC组)、共转染miR-365-3p与pcDNA3.1(miR-365-3p+pcDNA3.1组)、miR-365-3p与pcDNA3.1-PTEN(miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN组)。转染12 h后，更换为新鲜培养基。再培养24 h，检测细胞中miR-365-3p或PTEN表达验证转染效果，并收集细胞用于后续实验。

1.3.4MTT检测细胞增殖 将miR-365-3p组、miR-NC组、miR-365-3p+pcDNA3.1组和miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN组细胞以2.5×104个/孔接种于96孔板中，培养24 h后，加20 μl MTT。孵育4 h后，弃上清液。加150 μl二甲基亚砜，室温孵育5 min后，震荡混匀，于酶标仪490 nm测吸光度(A)值。增殖抑制率(%)=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%。

1.3.5流式细胞仪检测细胞凋亡 将miR-365-3p组、miR-NC组、miR-365-3p+pcDNA3.1组和miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN组细胞以1.0×105个/孔细胞接种于24孔板中，培养24 h后，收集细胞，用AnnexinV-FITC/PI试剂盒检测各组细胞凋亡情况。

1.3.6Transwell检测细胞迁移和侵袭 迁移实验：取100 μl miR-365-3p组、miR-NC组、miR-365-3p+pcDNA3.1组和miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN组细胞悬液加至Transwell小室的上室(1.0×104个/室)，500 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基加至下室。培养24 h，无菌棉签擦去上室未迁移细胞，用4%多聚甲醛固定、结晶紫染色后，显微镜下观察并计数。侵袭实验：预先将基质胶铺于Transwell上室，凝固后，再加100 μl细胞悬液，后续操作同迁移实验。

1.3.7Western印迹检测蛋白表达 将miR-365-3p组、miR-NC组、miR-365-3p+pcDNA3.1组和miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN组细胞以1.0×105个/孔细胞接种于24孔板中，培养24 h后，收集细胞。RIPA裂解液提取细胞中总蛋白，BCA法定量后，行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳。然后将分离蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，于5%脱脂奶粉溶液中室温封闭2 h。于4℃冰箱中分别用细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关x蛋白(Bax)、钙黏附蛋白-E(E-cadherin)、MMP-2、PTEN和GAPDH一抗孵育过夜。洗膜后，加辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育2 h。加显影液，避光显影，曝光拍照后，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.3.8双荧光素酶报告基因实验 采用PCR技术对含miR-365-3p结合位点的PTEN的3′UTR进行扩增，构建PTEN的3′UTR野生型荧光素酶载体(WT-PTEN)和突变型荧光素酶载体(MUT-PTEN)。将对数期软骨细胞以每孔5.0×105个/孔接种于6孔板中，培养24 h后，弃培养基，用LipofectamineTM2000试剂盒分别共转染WT-PTEN与miR-365-3p mimics、WT-PTEN与miR-NC、MUT-PTEN与miR-365-3p mimics、WT-PTEN与miR-NC。转染12 h后，更换新鲜培养基。再培养24 h，收集细胞并裂解。将裂解液3 500 r/min离心5 min后，取上清检测荧光素酶活性。

1.4统计学分析 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1骨关节炎患者软骨组织中miR-365-3p表达水平 与正常对照组miR-365-5p水平(0.22±0.02)比较，骨关节炎组(0.67±0.07)显著升高(t=47.880,P=0.000)，表明miR-365-3p在骨关节炎患者软骨组织中高表达。

2.2过表达miR-365-3p对软骨细胞增殖、凋亡的影响 与miR-NC组比较，miR-365-3p组软骨细胞中miR-365-3p表达、细胞增殖抑制率、凋亡率及细胞中p21、Bax蛋白表达均显著升高(均P<0.05)，CyclinD1和Bcl-2蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见图1、图2、表1和表2。

表2 过表达miR-365-3p对软骨细胞凋亡的影响

图1 过表达miR-365-3p对软骨细胞增殖、凋亡的影响

图2 Western印迹增殖、凋亡相关蛋白的表达

表1 过表达miR-365-3p对软骨细胞增殖的影响

2.3过表达miR-365-3p对软骨细胞迁移、侵袭的影响 miR-365-3p组迁移细胞数、侵袭细胞数及MMP-2蛋白表达均显著低于miR-NC组(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达显著高于miR-NC组(均P<0.05)。见图3、图4、表3。

图3 Western印迹检测过表达miR-365-3p对软骨细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响

图4 过表达miR-365-3p对软骨细胞迁移、侵袭的影响(结晶紫，×200)

表3 过表达miR-365-3p对软骨细胞迁移、侵袭的影响

2.4miR-365-3p靶向调控PTEN表达 TargetScan生物信息学软件预测显示的PTEN的3′UTR与miR-365-3p的结合位点见图5。共转染WT-PTEN与miR-365-3p mimics的细胞荧光素酶活性显著低于共转染WT-PTEN与miR-NC的细胞荧光素酶活性(P<0.05)，而共转染MUT-PTEN与miR-365-3p mimics的细胞荧光素酶活性与共转染MUT-PTEN与miR-NC的细胞荧光素酶活性比较无显著变化(P>0.05)，见表4。与miR-NC组比较，miR-365-3p组PTEN mRNA与蛋白表达显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-365-3p组PTEN mRNA与蛋白表达显著升高(P<0.05)，见图6、表5。

图5 PTEN的3′UTR含有miR-365-3p的互补序列

表4 双荧光素酶报告实验

1～4:miR-NC组、miR-365-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-365-3p组图6 Western印迹检测PTEN表达的影响

表5 miR-365-3p调控PTEN的表达

2.5过表达PTEN能逆转过表达miR-365-3p对软骨细胞增殖、凋亡的影响 miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN组软骨细胞增殖抑制率、凋亡率及p21和Bax蛋白表达均显著低于miR-365-3p+pcDNA3.1组(P<0.05)，PTEN、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达均显著高于miR-365-3p+pcDNA3.1组(P<0.05)。见表6、表7、图7。

表6 过表达PTEN能逆转过表达miR-365-3p对软骨细胞增殖的影响

表7 过表达PTEN能逆转过表达miR-365-3p对软骨细胞凋亡的影响

1～2：miR-365-3p+pcDN-3.1组、miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN组，下图同图7 过表达PTEN 能逆转过表达miR-365-3p对软骨细胞增殖凋亡蛋白表达的影响

2.6过表达PTEN逆转过表达miR-365-3p对软骨细胞迁移、侵袭的影响 miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN组迁移细胞数、侵袭细胞数及MMP-2蛋白表达均显著高于miR-365-3p+pcDNA3.1组(P<0.05)，而E-cadherin蛋白表达显著低于miR-365-3p+pcDNA3.1组。见表7、图8。

1～2：miR-365-3p+pcDN-3.1、miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN图8 过表达PTEN逆转过表达miR-365-3p对软骨细胞迁移侵袭蛋白表达的影响

3 讨 论

骨关节炎是一种退行性疾病，在老年人群中具有较高的发病率〔9〕。正常的关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质组成，软骨细胞在维持软骨完整性、关节软骨的负重功能及软骨损伤和重塑等方面发挥重要作用〔10〕。软骨细胞生物学行为的异常是骨关节炎进展的重要原因之一〔11〕。研究表明，miRNA参与调控骨关节炎的发生进程〔12〕。miR-193b-3p靶向组蛋白去乙酰化酶3调节人软骨细胞间充质干细胞的软骨形成和代谢〔13〕；miRNA-130a在骨关节炎患者血清中表达水平降低，下调miRNA-130a表达可能通过抑制PTEN/PI3K/Akt信号通路抑制软骨细胞增殖，并诱导软骨细胞凋亡〔14〕；miR-222在骨关节炎软骨细胞中表达下调，过表达miR-222通过下调HDAC-4和MMP-13水平抑制软骨细胞的凋亡〔15〕。提示miR-365-3p有可能成为骨关节炎治疗的分子靶点。

PTEN是目前发现的具有磷酸酶活性的抑癌基因，其与骨关节炎的发生发展也密切相关。研究表明，敲除小鼠关节软骨细胞中的PTEN/PI3K/Akt信号通路过度持续激活，进而导致骨关节炎的发生〔16〕；PTEN在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中表达下调，参与类风湿关节炎的发生和发展〔17〕；过表达miR-181通过靶向调控PTEN表达抑制软骨细胞增殖，并促进软骨细胞凋亡〔18〕。提示miR-365-3p可能通过抑制PTEN来阻碍软骨细胞增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡。

综上，miR-365-3p在骨关节炎软骨组织中表达上调，过表达miR-365-3p对骨关节炎软骨细胞增殖、迁移和侵袭发挥抑制作用，而对细胞凋亡起促进作用，其作用机制可能与靶向抑制PTEN表达有关，miR-365-3p/PTEN轴可能为骨关节炎的治疗提供了的潜在靶点。