生物信息学及实验验证分析SPRR2A基因在肺鳞癌中的表达和临床意义

周静 何杰 李小燕 王国栋 余觅 张维 肖秋红

1成都医学院临床医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科 610500;2 牟平区中医医院病理科,烟台264100

肺癌是全球发病率最高的呼吸系统恶性肿瘤之一。在中国,肺癌的发病率和病死率也是居于多种恶性肿瘤的首位[1]。根据组织病理学分型,肺癌可分为非小细胞肺癌与小细胞肺癌两大类[2]。肺鳞状细胞癌是非小细胞肺癌的常见类型之一,约占15%～20%[3]。据报道,肺鳞癌全球每年新发病例约40万例,虽然该疾病与吸烟密切相关,但肺鳞癌潜在的分子发病机制尚不清楚[4]。同时,肺鳞癌因缺乏有效的早期诊断筛查和靶向药物治疗,在一定程度上造成了肺鳞癌较高的发病率和病死率[5-6]。

富含脯氨酸小蛋白2A (small proline-rich protein 2A,SPRR2A)基因是10个SPRR 基因家族中的成员之一,主要编码表皮分化复杂区域SPRR 基因家族编码的蛋白,与细胞分化密切相关,并与其他分化相关基因共同构成表皮分化复合体,协同影响肿瘤细胞的分化[7]。有研究表明SPRR2A 在胃癌组织高表达,胃癌患者血清SPRR2A 水平增高多伴有淋巴结的转移[8]。Nisa等[9]研究也证明SPRR2A 与头颈部肿瘤的转移和复发存在相关性,淋巴结转移灶中的SPRR2A 呈现高表达。但SPRR2A 在肺鳞癌中的研究尚未报道。本研究通过TCGA 为主的多个数据库及R 软件,挖掘肺鳞癌患者中SPRR2A 的表达水平及对肺鳞癌患者预后的影响,并通过临床样本及细胞实验进行验证,为研究肺鳞癌的诊治和评估肺鳞癌患者预后提供一定的实验证据。

1 资料与方法

1.1 资料来源 SPRR2A 表达采用生物信息学方法,首先在GTEx (http://www.gtexportal.org/home/)数据库中检索SPRR2A 基因在人体不同组织器官中的表达水平。在TCGA 数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中分析SPRR2A在不同肿瘤组织及在肺鳞癌中的表达。采用TCGA 数据库在线分析网站 (http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)比较肺鳞癌患者癌组织和癌旁组织中SPRR2A 基因表达水平。从TCGA 收集486例肺鳞癌和50例癌旁组织的基因表达谱数据和临床资料,使用R3.6.1软件将FPKM 的数据格式转换为TPM 格式用于后续分析。使用ROC曲线评估SPRR2A 的表达量对诊断肺鳞癌的效能。以SPRR2A 表达量的中位数值为区分界限,将肺鳞癌样本划分为SPRR2A 高表达组和低表达组。

1.2 材料和试剂 4 株人肺鳞癌细胞系 (SKMES-1,H226,HB-99,H520)和人肺上皮细胞系 (BEAS-2B)购于上海生命科学院;FBS、OptiMEN 及DMEM 购于美国Gbico公司;胰酶消化液购于美国Hyclone公司;Transwell小室购于美国Coring公司;shRNA-SPRR2A 及sh RNA对照组质粒寡核苷酸片段由上海合生生物技术有限公司合成;脂质体Lipofectamine 2000 购于美国Invitrgen公司;SPRR2A 引物序列由杭州齐步生物科技有限公司合成。

1.3 RT-qPCR 和蛋白免疫印迹法 (Western blot,WB)验证肺鳞癌组织和细胞系中SPRR2A的表达差异 在2018 年1 月至2020 年12 月间,从成都医学院第一附属医院外科接受肺癌切除术的患者中收集了40 对人肺鳞癌样本和距肿瘤至少5 cm的癌旁正常组织样本。所有肺鳞癌标本均经病理证实。从这些样品和细胞株中获取总RNA 和蛋白质。

1.3.1 RT-qPCR 检测 使用Trizol提取组织和细胞中总RNA,将500 ng 总RNA 反转录为cDNA。使用上海谷研PCR 试剂盒进行RT-qPCR反应,采用20μl反应体系,其中包含0.8μl引物,2μl cDNA 模板,10μl PCR 反应Mix以及7.2μl双蒸水。采用β-actin作为内参。SPRR2A 上游引物:5'-AGCAGTGCCAGCAGAAATA-3';下 游引物:5'-GGAACGAGGTGAGCCAAATA-3';BACTIN 上游引物:5'-GCTTCTAGGATCCTCTGGCT-3',下游引物:5'-TCCCTTACCCCAGTCTCATA-3'。采用2-ΔΔCt法计算SPRR2A 基因的相对表达量。

1.3.2 WB检测 裂解并收集组织和细胞中的总蛋白。使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。吸取50μg蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶分离,电泳完成后用半干转法将蛋白质转移到PVDF膜上,将膜用5%脱脂牛奶室温密封1 h,然后与一抗4 ℃孵育过夜,再与二抗室温孵育1 h。将增强化学发光 (enhanced chemiluminescence,ECL)滴入PVDF 膜中,后使用曝光机观察并拍照。选用内参β-actin。

1.4 SPRR2A 差异基因分析 来自TCGA 数据库中的SPRR2A 高表达组和SPRR2A 低表达组患者之间的差异基因分析通过Wilcoxon秩和检验在R软件中的”limma”程序包中进行分析。设定阈值调整后P＜0.05和|log2FC|＞1.5。所有的差异基因都以热图和火山图形式呈现。

1.5 基因富集分析 采用GSEA 4.1.0软件对SPRR2A 高、低组的差异基因进行京都基因和基因组百科全书 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics,KEGG)富集分析,设定统计方法为缺省加权富集,随机组合次数设定为1 000次,当P＜0.05且错误发现率 (false discovery rate,FDR)＜0.25时,该KEGG 通路为显著富集通路。

1.6 SPRR2A 表达与患者生存预后分析 利用R3.6.1软件Survival包分析2组之间预后的差异,根据下载整理的临床病例信息和SPRR2A 表达量,比较SPRR2A 高、低表达组间无疾病进展生存和总生存是否存在差异。

1.7 细胞转染 将SPRR2A 表达量最高的SKMES-1株作为研究对象,胰酶消化生长良好的SK-MES-1细胞,离心计数后,将其接种于6孔板中,在无双抗含10%FBS培养液中培养48 h,待6孔板中细胞融合度达65%左右时,进行OptiMEM和脂质体Lipofectamine 2000 介导转染。分别对sh RNA 阴性对照组、sh RNA-SPRR2A 实验组进行转染,转染6 h后,无双抗含10%的FBS培养基替换原来的培养基,继续培养48 h后,建立细胞模型进行后续实验。

1.8 Transwell实验 使用胰酶将细胞消化为单个细胞,洗涤1次,然后用无血清培养液再悬浮,将Transwell小室放置于24 孔板中,侵袭试验时在小室的下层添加700μl含20%血清的DMEM-H培养液,上层添加1×105个细胞和无血清稀释的基质胶,确保上层和下层无气泡产生,迁移实验上层小室不添加基质胶。37 ℃和5% CO2培养箱中培养24 h后,小室内弃掉上层培养液,1 ml甲醇室温固定15 min,再PBS洗涤1次,使用1%结晶紫染色15 min,清水冲洗,并用棉棒擦洗干净下室,普通显微镜下观察拍照。Image J软件计算迁移和侵袭的细胞数量。

1.9 统计学分析 采用R 3.6软件进行数据分析,TCGA 数据库中,肿瘤组织和癌旁组织差异基因分析采用非参数秩和检验。临床标本肿瘤组织和癌旁组织SPRR2A 的表达差异比较采用配对t检验。SPRR2A 高、低表达组间的总体生存率比较采用Kaplan-Meier 法。sh RNA-SPRR2A 组 和sh RNA阴性对照组侵袭和迁移细胞比较,采用独立样本t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SPRR2A 表达水平分析 TCGA 数据库和GTEx中数据库中,SPRR2A 基因m RNA 在人体各个组织中表达水平存在差异,肺鳞癌患者癌组织中的SPRR2A m RNA 表达水平明显高于癌旁正常组织(P＜0.05)。采用ROC 曲线评估SPRR2A对肺鳞癌的识别能力,AUC=89.9%,敏感度81.08%,特异度93.88%,P＜0.05,提示SPRR2A 可能是诊断肺鳞癌的分子标志物,见图1～3。

图1 SPRR2A 在不同肿瘤组织中的表达

图2 SPRR2A 在肺鳞癌组织和癌旁正常组织表达

图3 SPRR2A 对于肺鳞癌的诊断价值

2.2 组织学验证 成都医学院第一附属医院外科手术获得肺鳞癌组织和癌旁正常组织40 例(1∶1),通过RT-qPCR 和WB试验分析肺癌患者肺鳞癌组织和癌旁正常组织SPRR2A m RNA 和SPRR2A 蛋白表达。肺鳞癌组织中的SPRR2A m RNA 和SPRR2A 蛋白的表达均高于癌旁正常组织,差异有统计学意义 (P＜0.01),见表1,图4。

表1 2组SPRR2A 基因表达 ()

表1 2组SPRR2A 基因表达 ()

图4 肺鳞癌组织和癌旁正常组织中SPRR2A 蛋白表达A:蛋白电泳图;1为癌旁正常组织,2为肺鳞癌组织;B 柱状图

2.3 肺癌细胞系验证 将4株肺鳞癌细胞系SKMES-1、H226、HB-99、H520与正常人肺上皮细胞系BEAS-2B 进行对比。在4种细胞系中有3株SK-MES-1,H226,HB-99的SPRR2A m RNA 和SPRR2A 蛋白表达水平均高于正常人的肺上皮细胞系BEAS-2B,差异有统计学意义 (均P＜0.05)。见表2,图5。

表2 不同肺癌细胞系中SPRR2A 基因的表达 ()

表2 不同肺癌细胞系中SPRR2A 基因的表达 ()

图5 各种肺癌细胞株SPRR2A 蛋白表达情况 A:蛋白电泳图;3为BEAS-2B;4为H520;5为H226;6为SK-MES-1;7为HB-99;B:柱状图

2.4 SPRR2A 差异基因及所富集的KEGG 通路本研究将TCGA 数据库中的SPRR2A 高表达肺鳞癌243例与SPRR2A 低表达243例进行比较,共筛选出348个下调的基因和180个上调的基因,排列前10 的差异基因的热图,所有基因的火山图,差异基因主要富集于细胞黏附分子(FDR=0.021,P＜0.05)和囊泡运输的相互作用 (FDR=0.018,P＜0.05)两个信号通路。见图6～8。提示SPRR2A 可能和肿瘤的侵袭和迁移有关。

图6 差异基因的热图

图7 差异基因的火山图

图8 差异基因富集的信号通路 A 为细胞黏附分子通路;B为囊泡运输相互作用通路

2.5 SPRR2A 表达与患者预后关系 结果显示,SPRR2A m RNA 水平对肺鳞癌患者的总生存期和无疾病进展生存期均有显著影响;与低表达组相比,SPRR2A m RNA 高表达组的肺鳞癌患者总生存时间和无疾病进展生存期均短于低表达组(HR=1.60,P＜0.05;HR=1.69,P＜0.05)。见图9。

图9 SPRR2A 的表达与患者预后的关系

2.5 Transwell实验结果 GSEA 通路显示,高表达SPRR2A 样本的差异基因主要富集于和肿瘤侵袭和迁移相关的通路上,本研究选取SPRR2A表达最明显的细胞株SK-MES-1 作为研究对象,敲减了SPRR2A 基因 (shRNA SRRP2A 组),Western blot检测结果显示,敲减的SK-MES-1细胞系(sh RNASPRR2 A组)SPRR2 A表达下调,提示敲减SPRR2A 成功。因此,本实验采用对敲减了SPRR2A 基因的SK-MES-1细胞,进行侵袭和迁移实验。shRNA-SPRR2A 组迁移的细胞数明显低于sh RNA 阴性对照组,侵袭的细胞数也低于sh RNA 阴性对照组 (P值均＜0.05),见表3 和图9～11。

表3 两组侵袭和迁移试验结果比较 ()

表3 两组侵袭和迁移试验结果比较 ()

图10 Western blot检测敲减SPRR2A 结果 A:蛋白电泳图;B:柱状图;1为shRNA SRRP2A 组;2 为shRNA 阴性对照组

图11 敲减SPRR2A 对肺鳞癌细胞的迁移和侵袭的影响 A:shRNA 阴性对照组SK-MES-1细胞迁移检测结果;B:sh RNA SRRP2A 组SK-MES-1细胞迁移检测结果;C:shRNA 阴性对照组SK-MES-1细胞侵袭检测结果;D:shRNA SRRP2A 组SK-MES-1细胞侵袭检测结果

3 讨论

脯氨酸小蛋白 (small proline-rich proteins,SPRR)是一个基因家族,这个基因家族由2 个SPRR1基因、7个SPRR2基因、1个SPRR3基因共同组成,这些基因主要是一些分布位置极为相近且基因序列高度相似的小基因,参与组织器官的上皮细胞的分化,并且和屏障系统密切相关[10]。研究表明SPRR2A 在肺、胃肠道、前列腺、胆管和乳腺组织中呈现差异性表达,可以通过活性氧干扰细胞迁移,影响组织修复及伤口愈合等[11]。对于SPRR2A 在肿瘤中的研究较少,主要集中在消化道肿瘤及头颈部肿瘤的研究中,Fang等[12]研究报告表明SPRR2A 在舌鳞状细胞癌中低表达,诱导过表达SPRR2A 可以轻微促进肿瘤细胞的增殖,但减少了舌鳞状细胞癌的远处转移。但在许晓明等[10]研究的胃癌细胞中,SPRR2A 可以促进癌组织细胞周围上皮细胞向间质细胞转变 (epithelial mesenchymal transition,EMT)的形成,进而促进胃癌细胞的转移和浸润。同一个基因在不同的肿瘤组织中的表达具有特异性,而SPRR2A 在肺鳞癌中的表达与预后的关系、功能以及涉及的具体分子机制并未完全清楚。

本研究结果显示,在TCGA 数据库中,与癌旁正常组织比较,SPRR2A mRNA 在肺鳞癌组织中表达水平上调,上述结果得到了临床标本和不同分化能力的肺鳞癌细胞株的验证。在ROC 曲线分析中,结果显示AUC 89.9%,敏感度81.08%,特异度93.88%,提示SPRR2A 基因具有一定的鉴别肺鳞癌的诊断能力,可以作为诊断肺鳞癌的一个可靠的分子标志物。通过R 软件行生存预后分析得出SPRR2A 高表达的肺鳞癌患者总生存时间更短,而且较高的SPRR2A 水平提示较低的无复发生存率,说明SPRR2A 基因在肺鳞癌中可能起到促癌作用。为了进一步探究SPRR2A 在肺鳞癌中的分子机制,将高表达和低表达SPRR2A 的患者的基因图谱进行差异基因分析,共筛选出348个下调的基因和180个上调的基因,差异基因主要富集于细胞黏附分子和囊泡运输的相互作用两个信号通路。

各类黏附分子的平衡表达对于维持上皮细胞正常结构和功能稳态具有重要意义,细胞间的连接缺失是上皮间质转化的关键环节[13]。肺上皮细胞具有极性,上皮细胞与上皮细胞之间、细胞与基底之间存在多种跨膜的黏附蛋白,上皮细胞依靠这些细胞黏附分子以及由黏附分子穿插组装成的各类细胞连接共同维持上皮结构和功能的动态稳定[14]。细胞外囊泡是由多种细胞释放到胞外空间的一类具有双层膜结构的囊泡,其中装载有DNA、RNA、蛋白质、脂质等其他小分子物质,可以在细胞通讯中发挥信号传递的作用[15]。研究发现,胞外囊泡在不同的组织中具有高度异质性,参与了肿瘤的发生、转移及免疫逃逸[16]。因此本研究推测高表达SPRR2A 的患者预后更差,可能跟SPRR2A 参与了生物信息分析所得出的细胞黏附分子和囊泡运输的相互作用通路有关,这两条通路影响肺鳞癌的迁移和侵袭,高表达SPRR2A 的肺鳞癌患者可能更容易发生转移。为了验证这一猜想,本研究通过构建转染sh RNA-SPRR2A 质粒的SK-MES-1细胞,进一步证明了敲减SPRR2A 后,肺鳞癌SK-MES-1细胞的迁移和侵袭都受到了抑制。

Xu 等[8]在胃癌的研究中显示结合血清SPRR2A 浓度与癌胚抗原浓度的检测有助于诊断早期胃癌的发生,患者血清SPRR2A 水平与淋巴结转移和TNM 分期密切相关。这与本实验研究结果有一定的一致性。Mizuguchi等[17]研究报告指出在胆管癌中,SPRR2A 诱导的上皮间质转化增加了胆管癌的局部侵袭性,这可能与SPRR2A 参与了结合锌指蛋白1和羧基末端结合蛋白,三者形成了蛋白复合物结合在miR-200c/141 的启动子上,导致了miR-200c/141 转录的协同抑制作用有关。目前有研究认为SPRR2A 促进细胞的迁移和上皮间质转化有关。在胆管癌细胞中,过表达SPRR2A 会导致细胞侵袭性增加,SPRR2A 促进EMT 这一过程,主要与信号转导子和转录激活子3/表皮生长因子受体/酪氨酸激酶受体2轴激活有关[18]。但目前关于SPRR2A 在肺鳞癌中的具体分子机制研究很少,SPRR2A 在肺鳞癌的发生过程也有可能通过促进癌组织细胞周围EMT 形成,促进肺鳞癌的转移和浸润,这与本研究中高、低表达SPRR2A 组的差异基因主要富集在黏附分子信号通路相一致,其具体的直接作用机制需进一步的实验验证。

综上所述,SPRR2A 在肺鳞癌中表达升高,高表达SPRR2A 的患者预后更差,可能与SPRR2A 影响肺鳞癌细胞的侵袭和迁移有关,但具体调控的基因和分子机制尚待进一步研究。本文结合生物信息分析初步探讨SPRR2A 与肺鳞癌侵袭和迁移的关系,有望作为临床上治疗肺鳞癌的新靶点及生物标志物。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突