T 细胞和TIDC细胞与肿瘤生长和转移的关系

张鹏 万子扬 王勇

1陆军军医大学第二附属医院新桥医院胸外科,重庆 400037;2泸州市中医医院胸外科 646000;3四川省邻水县人民医院急诊科,广安638500

据相关调查发现,肺癌尤其是非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC),已是全球范围内的高危癌症,其发病率和致死率分别达11.6%和18.4%,而且每年都处于持续上升状态[1]。其主要特点是手术切除后复发率高,同时对化疗和放疗产生了耐药性。对于NSCLC 的发生机制,有研究认为NSCLC的肿瘤细胞生长速度大于消灭速度,造成了人体免疫系统紊乱,此外T 细胞通过参与抑制机体的免疫机制,加快了肿瘤的发生发展[2]。因此出现了相关的免疫检查点抑制药物,并产生巨大效益,但是仅限于少部分患者。这表明免疫分子只是肺癌免疫抑制机制大网络的一部分,需要继续研究肿瘤相关免疫的复杂机制,也需要进一步对肺癌微环境中免疫细胞的生物学特性进行深入探索[3-6]。相关数据显示,机体的免疫功能以及肿瘤的发生发展与调节性T 细胞 (regulatory T cells,Treg)有一定的关系[7],Treg细胞的免疫抑制性,不仅针对CD4+CD8+T 细胞,对非特异性细胞如树突细胞也有作用。肿瘤的免疫逃逸现象也和树突状细胞 (dendritic cells,DC)功能障碍有关[8]。本研究通过拟Lewis肺癌动物模型探索T 细胞和肿瘤浸润树突状细胞 (tumor infiltrating dendritic cell,TIDC)的分布和浸润情况与肿瘤生长和转移的关系,为今后的NSCLC研究做基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及细胞来源 实验性研究。将42只c57bl/6近交系雄性小鼠饲养1周,8周龄左右,体质量达18～20 g,由陆军军医大学第二附属医院合作的医学院动物实验室提供,自由饮食进水,实验室条件为70%的湿度,25 ℃的室温。实验抗体CD4PE、CD8PE、异硫氰荧光素 (FITC)、CD44 APC、CD62L PE-Cy7购自美国Biogen;固定膜渗透液和跨膜洗剂购自美国eBIO Science公司。Lewis肺癌细胞购买于中国科学院上海细胞生物学研究所。DMEM 培养基、RPMI-1640、胎牛血清,购于美国Gibco公司。

1.2 动物模型建立[9]从液氮中取出Lewis肺癌细胞复苏,用培养基 (10%胎牛血清+RPMl640培养基)培养3～4 代,收集Lewis肺癌细胞用PBS稀释细胞浓度至5×106个/ml,抽取0.2 ml分别在每只小鼠右腋下注入。42只随机分为T 细胞组、TIDC细胞组和对照组,每组14只。Lewis肺癌细胞注入完毕后,T 细胞组回输5×104个CD4+CD8+Treg细胞,细胞浓度为1×106个/ml;TIDC细胞组回输2.5×104个TIDC 细胞,细胞浓度为5×105个/ml;对照组回输等量PBS。

1.3 记录小鼠瘤体体积及其生存状态的变化 模型制作成功后,需定时观察瘤体体积的变化,于1、5、9、13、17、21 d分别用卡尺测量肿瘤的最长、最短直径,计算肿瘤体积为 (长径×短径2)/2。于21 d 测量完毕后,记录下小鼠的生存状态。

1.4 流式检测CD4+CD8+Treg细胞及TIDC细胞水平 采用二氧化碳安乐死,处死小鼠后无菌条件下取外周血和移植瘤,剪刀剪碎,用70μm 尼龙膜进行过滤,收集到的组织进行离心,1 500 r/min,离心15 min,弃去上清,流式细胞染色液清洗两次,备用流式检测。

1.5 HE染色法检测肺部转移性肿瘤结节 小鼠的肺组织用多聚甲醛固定24 h,脱水制成蜡状物,包埋、切割、染色并拍照。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7医学绘图软件对试验所得数据整理、分析。其中计量资料以表示,计数资料采用例数(%)表示,组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验,不同时点的观察比较采用重复测量的方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物观察 小鼠接种Lewis肺癌细胞1周后,接种处可触摸到黄豆大小的肿块,随着时间延长,可见小鼠接种处瘤块逐渐增大。小鼠的活动性,饮食逐渐减少,毛发光泽度降低。随着接种时间延长,TIDC 细胞组小鼠的精神状态、饮食情况、毛色光泽等较好,以其为标准比较其余各组,T 细胞组最差,对照组最好,见表1。

表1 接种Lewis肺癌细胞21 d后各组小鼠生存状态变化

2.2 3组小鼠肿瘤体积变化 随着观察时间的延长,3组小鼠的瘤体体积都逐渐增加,T 细胞组小鼠肿瘤体积增加最大,依次TIDC 细胞组、对照组,3组的组间、不同时点间差异均有统计学意义(P＜0.05),而组间和不同时点的交互作用差异无统计学意义(P＞0.05),见表2。

表2 接种Lewis肺癌细胞各组小鼠肿瘤体积变化 (,cm3)

表2 接种Lewis肺癌细胞各组小鼠肿瘤体积变化 (,cm3)

2.3 3组CD4+T 细胞、CD8+T 细胞和TIDC 细胞水平 流式结果显示,Lewis肺癌动物模型的效应和记忆效应CD4+、CD8+T 细胞和TIDC 细胞在总淋巴细胞中的比例,T 细胞组和TIDC细胞组均高于对照组,T 细胞组高于TIDC细胞组,差异均有统计学意义(P＜0.05),见表3。

表3 3组小鼠的CD4+CD8+T 细胞和TIDC细胞比例 (,%)

表3 3组小鼠的CD4+CD8+T 细胞和TIDC细胞比例 (,%)

注:与对照组比较,a P ＜0.05;与TIDC 细胞组比较,b P ＜0.05

2.4 3组小鼠肺部转移性肿瘤结节数比较 回输CD4+CD8+Treg细胞及TIDC 细胞后,小鼠肺部转移性肿瘤结节数量显著增多,组织染色结果显示,T 细胞组转移性肿瘤结节数多于对照组和TIDC组,TIDC组多于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05),见表4,图1、图2。

图2 3组小鼠的肺部转移性肿瘤结节情况

表4 3组小鼠转移性肿瘤结节数比较 (,个)

表4 3组小鼠转移性肿瘤结节数比较 (,个)

注:a 与对照组比较P ＜0.05;b 与TIDC细胞组比较P ＜0.05

图1 3组小鼠的肺部转移性肿瘤结节 A 为正常肺组织;B为切除的组织块;C 为显微镜下形态 HE ×40;D为TDC细胞组正常肺组织;E 为TDC 细胞组切除的组织块;F为TDC细胞组显微镜下形态 HE ×40;G 为T 细胞组正常组组织;H 为T 细胞组切除的组织块;I为T 细胞组显微镜下形态 HE ×40

3 讨论

肺癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,即便在肿瘤切除后,其生存率也十分低下,根据发病机制主要可以分为小细胞肺癌及NSCLC[10],目前的针对性治疗手段主要有靶向治疗和免疫治疗。临床治疗中较为热门的靶向药物主要有伊马替尼、厄洛替尼和吉非替尼,在治疗NSCLC、慢性白血病中起到了重要的作用,然而在大量的小细胞肺癌临床治疗中发现上述药物的疗效较差,无法达到满意的治疗效果。有试验研究证明,这些药物是在基因的KIT、表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,EGFR)等位点发生突变的基础之上来发挥治疗肺癌的作用的,而小细胞肺癌中不会出现这种现象。另有研究显示,机体血管内皮生长因子水平的上升会促进小细胞肺癌的发生发展,但临床采用血管生成抑制剂的治疗手段未收到令人满意的治疗效果,癌症患者的生存率并无显著提高。考虑到上述小细胞肺癌的特性,相关学者及研究人员开始以蛋白质降解的途径以及酪氨酸激酶受体作为目标,继续开发新型的靶向治疗方法[11-12]。NSCLC的靶向治疗方法主要为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 (epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)和间变性淋巴瘤激酶 (anaplastic lymphoma kinase,ALK)抑制剂。EGFR-TKI以吉非替尼和厄洛替尼作为代表性药物,吉非替尼于2005年在国内上市,其临床疗效较好,显著提高了患者的生存率,但在大量临床研究中发现,吉非替尼对于基因突变型患者的疗效显著,而野生基因型患者收益较差。相较于吉非替尼,厄洛替尼的药物不良反应发生率相对较低,广泛应用于肺癌的晚期治疗,能有效延长患者的生存期。但在长期的临床应用中,EGFR-TKI出现了 “继发性耐药”的现象,患者在长期应用该药物后,疗效会逐步降低,癌症仍进一步发展恶化[13]。因此,解决靶点、耐药等问题,加快新型靶向药物的研发仍是一项紧急的任务。

肺癌的免疫治疗方法主要为以下几个方面:(1)免疫检查点抑制剂:其主要的研究方向是借助单克隆抗体来阻遏对应的免疫检查点,例如细胞毒T 淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T lymphocyteassociated antigen-4,CTLA-4)抑制剂、程序性死亡受体1 (programmed cell death 1,PD-L1)抑制剂以及PD-1 抑制剂。其中PD-1 抑制剂纳武单抗在肺鳞癌的临床试验中收效明显,能有效的提高患者的生活质量,延长生存时间;帕姆单抗在非鳞状NSCLC的初期治疗上应用有所研究,能显著延缓肿瘤进程,抑制癌细胞的扩散、转移;此外还有阿特珠单抗也已开展了相关的临床试验,能更为明显的延长非鳞状NSCLC 患者的生存时间。CTLA-4抑制剂的代表性药物—伊匹单抗,短期内能显著延长临床试验中非鳞状NSCLC 患者的生存时间,但后期试验收效不明显,抑制癌细胞扩散作用有所减弱[14]。(2)肺癌疫苗:以对应的肿瘤细胞为研究对象,采用基因修饰、化学因子的刺激,再经过辐射,就可以获得相对应的肺癌疫苗。但经过大量的临床试验表明,疫苗在延长患者的生存时间方面收益较差,临床疗效难以令人满意。(3)免疫调节剂:其借助消除癌症患者的免疫抑制和改善失调的机体免疫功能来治疗肿瘤,按作用机制的不同可以分为双向的免疫调节剂、免疫抑制剂及免疫增强剂。此类药物主要有卡介苗、干扰素β(interferon,INF-β)、INF-γ、INF-α 及转化生长因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)等[15]。INF-α在小细胞肺癌的临床试验中效果显著,患者生存收益较高;TGF-β则对早期癌症的治疗作用明显。但是,有研究表明它能促进发展期肿瘤细胞的扩散和转移。目前免疫调节剂的研究仍然缺乏,具体作用机制尚不清晰,有待于进一步的实验研究及开发。

由上可知,肺癌相关的治疗药物是十分多的,其作用机制也不尽相同,但在临床上具有明显收益的仍然较少,而且其对于患者的不良反应也是相当明显的,因此有必要寻求更为高效、安全、可靠的治疗手段。早在上世纪九十年代,日本学者通过小鼠实验研究发现,去除调节性T (CD4+CD25+T)细胞能诱发自身抗原发生免疫反应而导致多种疾病的产生,反过来将该细胞输入小鼠体内则可以产生明显抑制作用[16]。通过进一步研究发现,叉状头转录因子P3 (forkhead box P3,Fox P3)是CD4+CD25+T 细胞特异性的表达分子,同时也是Treg发育和功能相关的重要分子[17]。Treg可以分为天然性 Treg细胞 (natural regulatory T cells,n Treg)和诱导性Treg细胞 (inducible regulatory Tcells,i Treg),前者是由胸腺组织所产生的,在抑制肿瘤转移及侵袭过程中起着重要作用,而后者来源于CD4+T 细胞,其有着与n Treg完全相反的作用,通过抑制机体的免疫机制来促使肿瘤转移及侵袭[18-19]。天然性Treg细胞和诱导性Treg细胞的区分度不大,二者仍有一定的相似性,而且都对肿瘤的发生发展具有重要意义。

正常的机体免疫系统可以通过Treg细胞抑制CD4+CD8+T 细胞的活化和增殖来保持肿瘤细胞生成与去除的平衡,一旦这一平衡被打破,CD4+CD8+T 细胞就可借助各种途径诱发肿瘤逃逸,引起人体稳定状态的失衡[20]。本研究T 细胞组回输CD4+CD8+Treg细胞,发现小鼠精神萎靡,几乎瘫痪,缺乏食欲,毛发萎黄无光泽,肿瘤体积增加最大,肺部转移性肿瘤结节增加数量最多,表明CD4+CD8+Treg细胞对Lewis肺癌的侵袭和转移有一定的促进作用。肿瘤微环境中各细胞及细胞因子的相互作用对于肿瘤的侵袭和转移也有着重要作用[21-23]。已有相关研究数据显示,肺癌患者的病灶及外周血内均发现Treg 细胞表达水平显著增高[24-25]。本研究中T 细胞组效应和记忆效应CD4+、CD8+T 细胞和TIDC细胞在总淋巴细胞中占比均高于对照组,也表明机体CD4+CD8+Treg细胞和TIDC 细胞水平的变化通过影响肿瘤微环境,对肿瘤的侵袭和转移具有重要意义,提示可以利用通过降低CD4+CD8+Treg细胞水平,遏制肿瘤的转移,从而提高患者的生存率,这可能成为治疗肿瘤的一种新的有效手段。

TIDC可以在肺癌组织中检测到,未成熟TIDC可能参与肿瘤免疫逃逸。本研究中,TIDC细胞组回输TIDC细胞后,小鼠精神较为涣散、偶尔活动、饮食减少、毛发欠光泽,临床观察情况虽然优于T 细胞组,但与对照组相比仍有明显下降。小鼠肿瘤体积随时间延长逐渐增加,肺部转移性肿瘤结节也有所增加,增加程度依次为T 细胞组、TIDC细胞组和对照组。与CD4+CD8+Treg细胞相似,TIDC 细胞可促进Lewis肺癌的侵袭和转移,但次于CD4+CD8+Treg 细胞,提示也可将TIDC细胞作为肿瘤治疗的靶点。研究者们发现在肿瘤转移灶中,低的TIDC浸润密度常同时伴有低密度的肿瘤浸润淋巴细胞,这一现象提示,在肿瘤微环境中处于抗肿瘤免疫中心环节的两种细胞(树突状细胞DC 和效应T 细胞)的消长有着某种联系,TIDC是否可以通过某种方式募集T 细胞向肿瘤组织迁移还有待于进一步研究,更多的学者认为TIDC和Tib的浸润情况时作为肿瘤预后的独立因索[26]。本研究结果显示,TIDC细胞组Lewis肺癌动物模型外周血和移植瘤中效应和记忆效应CD4+T 细胞、CD8+T 细胞和TIDC 细胞在总淋巴细胞中占比虽然低于T 细胞组,但仍高于对照组,同样说明小鼠回输TIDC细胞后,可促进Lewis肺癌的侵袭和转移。

本试验结果证明了CD4+CD8+Treg 细胞和TIDC细胞不仅促进肿瘤组织原位生长发育,而且促进肿瘤细胞向远处组织的侵袭和转移,可以推测CD4+CD8+Treg细胞和TIDC 细胞在肺癌的发生中起着重要的作用,因而可以通过控制CD4+CD8+Treg细胞和TIDC 细胞来推迟肺癌的发展,为后续开发治疗药物奠定基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突