熄风化痰方对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积、氧化应激的影响

马 羚，刘 婷，房江山，尹佳琦，王 东，杜 帅，马 娜，李 丹，张 燕，沙地克·沙吾提，

急性脑缺血是指脑组织动脉局部供血突然减少或完全中断，导致局部组织出现损伤、细胞及神经元的损伤甚至凋亡，进而导致相关运动区域的功能障碍，严重影响病人的生命质量[1]。缺血性脑卒中的发生发展是一个复杂的病理过程，涉及氧化应激、细胞凋亡、兴奋性氨基酸、炎症反应和能量代谢障碍等多方面[2]。脑卒中是临床常见、多发性疾病，具有较高的发病率、致残率和病死率。据报道，我国每年有150万～200万例新发脑卒中病人，其致残率高达80%， 一旦发病会给病人及家庭带来沉重负担[3]。迄今为止没有特效治疗药物和预防药物。溶栓治疗恢复血液流通是脑缺血疾病的治疗方法，但是脑缺血再灌注损伤也是这个时期最为常见的脑功能异常的诱导因素。熄风化痰方源于《医学心悟》，是治疗风痰阻络型中风的代表方，具有息风化痰、活血通络之功效，正符合风痰阻络型中风的病机特点。本实验观察熄风化痰方对急性脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑梗死面积、氧化应激指标的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级雄性Wistar大鼠38只，高脂饮食8周，体质量240～280 g。由新疆医科大学动物实验中心提供，实验于新疆医科大学动物实验中心SPF级实验室进行，室温(22±3)℃，相对湿度60%～80%，光照周期12 h/12 h，自由进食、饮水。

1.2 实验试剂和仪器 大脑中动脉闭塞(MCAO)线栓(广州佳灵生物技术有限公司生产，L3400)，脑组织切片模具与刀片(上海玉研科学仪器有限公司)，酶标仪(Bio-Rad生产，xMarkTM)，四氮唑红(TTC)染液(南京建成生物工程研究所生产，D025-1-3)，苏木素染液(福州迈新生物技术开发有限公司生产，CTS-1097)，伊红染液(北京中杉金桥生物技术有限公司生产，ZLI-9613)，中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司生产，ZLI-9555)，丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所生产，A003-1)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所生产，A001-3)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒(南京建成生物工程研究所生产，A005)，总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(南京建成生物工程研究所生产，A0145)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 将38只大鼠随机分为3组。模型组：15只(取材8只)，每日灌服3.6 mL生理盐水，连续灌服2周，采用大脑MCAO线栓法阻断大脑中动脉，构建大鼠MCAO缺血再灌注模型，缺血2 h再灌注24 h，术后直接采血，断头取脑。中药组：15只(取材8只)，按9.21 g/kg每日灌服1次熄风化痰方3.6 mL，连续灌服2周，最后一次灌服为术前1 h，手术方式同模型组。假手术组：8只，每日灌服等体积生理盐水，连续灌服2周，手术方式同模型组，但不做栓塞，仅暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，然后逐层缝合，术后24 h采血，断头取脑。

1.3.2 建立动物模型 ①大鼠用2%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台上，颈部用碘伏消毒后正中偏右0.5 cm处纵向切开2 cm的切口。②分离右侧CCA、ECA、ICA，其中ECA需暴露3～5 mm，ICA需分离至翼腭动脉，在ECA远端距CCA 分叉处3～5 mm处结扎ECA。③用缝合线在上述结扎点远心端结扎ECA，用眼科手术剪在两个结扎点之间剪断ECA。④将ECA向鼠尾方向牵拉，使ECA和ICA成一条直线。⑤动脉夹夹闭CCA近心端及ICA远心端，在ECA结扎点前端剪一“V”形小口，缓慢将栓塞线经ECA插入ICA，打开ICA远心端动脉夹。⑥根据栓塞线上的标记，判断栓塞线插入深度。当CCA 分叉进入栓塞线1.8～2.2 cm标记之间区域时，插线力度一定要轻，稍感阻力立即停止向前插线。⑦在“V”形切口近心端结扎ECA，使栓塞线和ECA 固定在一起。⑧剪断各结扎点上的手术线，逐层缝合，将栓塞线多余的部分缝合在创口之间，暴露于皮外。缺血2 h再灌注的具体方法是将缝合线打开，完全暴露栓塞线，用眼科镊子固定结扎点，将栓塞线慢慢抽出，直至栓塞线上的0.6 cm处标记点暴露出来为止，剪掉栓塞线多余部分，逐层缝合创口。

1.4 检测指标

1.4.1 氧化应激指标检测 抽取腹主动脉血，4 ℃，3 000 r/min离心10 min，取上清液，-20 ℃保存，分别检测MDA、SOD、GSH-Px、T-AOC指标，检测方法按照检测试剂盒说明书进行。

1.4.2 脑梗死面积检测 大鼠断头取完整脑组织，每组6只大鼠脑组织用于TTC染色[4 ℃的磷酸缓冲盐溶液(PBS)浸泡后转移至-20 ℃冻存]，剩余2只大鼠脑组织用于苏木素-伊红(HE)染色(直接固定于4%多聚甲醛)。①TTC染色。取假手术组、模型组和中药组大鼠脑组织，用2%的TTC染料常规染色，根据病理图像分析脑梗死面积，具体操作如下：断头法处死大鼠后迅速取脑组织(10 min内)置于4 ℃的PBS溶液中浸泡后转移至-20 ℃冰箱冷冻30 min；切取冠状位脑片，厚度为2 mm，将脑片放入2%的TTC染料中37 ℃避光水浴30 min，每5 min轻微晃动容器，使充分染色；取出脑片用PBS溶液洗涤3～5 min进行拍照；选择每一切片的尾侧面用病理图文分析系统进行图像分析，测量每片的梗死面积和总面积。②HE染色：脑组织使用4%多聚甲醛固定36～48 h，石蜡包埋，切片厚度5 m，经脱蜡、脱二甲苯、水洗、HE染色等步骤，最后用中性树胶封片，镜下观察脑组织的病理变化情况。

2 结 果

2.1 3组氧化应激指标比较 与假手术组比较，模型组和中药组MDA水平升高，SOD、GSH-Px、T-AOC水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，中药组MDA水平降低，SOD、GSH-Px水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 3组氧化应激指标比较(±s)

2.2 3组脑梗死面积比较 与假手术组比较，模型组和中药组脑梗死面积增加，与模型组比较，中药组脑梗死面积减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图1。

图1 3组脑梗死面积柱状图

表2 3组脑梗面积比较(±s) 单位：mm2

2.3 3组脑组织的病理变化情况比较 镜下观察：假手术组神经元分布尚均匀，层次清晰，神经元结构较正常，神经胶质细胞结构尚清晰。模型组神经元分布尚均匀，层次欠清晰，部分核染色深、浓缩，未见核仁；部分核边界模糊；大部分神经元胞界不清，神经胶质细胞结构欠清晰。与模型组比较，中药组神经元细胞及胶质细胞病理改变明显减轻。详见图2。

图2 3组脑组织HE染色结果

3 讨 论

急性脑缺血属于中医缺血性中风病，从古至今，中风一直是人类的重大疾病，《内经》无“中风”之名，但对《内经》所载与中风临床表现相似病症及其病机的分析阐发，《内经》所述大厥、煎厥、薄厥、仆击、痱、风痱、偏枯、偏风、偏身不遂、偏身不用等病症，从发病形式、临床特征、病因病机等方面皆与中风类似[4]。国内中医急症脑病组认为中风是多种原因的“脑脉痹阻或血溢脑脉之外”所致，明确中风的病位在脑，与现代医学所说脑梗死或脑出血相似[5-7]。痰浊与瘀血是中风发病的主要病理产物及致病因素，并贯穿疾病发生发展的整个过程。《本草新编》指出：“中风未有不成痰血者也”[8]。中医学认为天人合一，人生活在自然界中，当人感受风邪后，以风邪、痰湿尤甚，复因饮食、情志、劳倦等所伤，导致体内风痰瘀阻、脉络不通，最终脏腑失调，气血逆乱而发为中风。脑血管堵塞后，使得大脑特定区域得不到血液的灌注和氧气、营养物质的支持，导致区域性的脑损伤和脑半球梗死，最终严重致残或死亡[9]。由于老年人气血瘀滞、脉络不畅、五脏功能衰退，因此，该病在老年人中发病率较高。风痰阻络证属于缺血性中风病急性期的主要证型之一，治疗关键在于息风化痰、活血通络，而熄风化痰方有息风化痰之功，主治中风病和中风后遗症等。

本研究结果显示，与假手术组比较，模型组和中药组脑梗死面积增加，血MDA水平升高，血SOD、GSH-Px、T-AOC水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，中药组脑梗死面积减少，血MDA水平降低，SOD、GSH-Px水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。可见熄风化痰方治疗脑缺血疗效较好。熄风化痰方中姜半夏燥湿化痰、降逆止呕，天麻平肝息风、止头眩，两者合用，为治疗风痰阻络中风之要药，李东垣《脾胃论》：“足太阴痰厥头痛，非半夏不能疗；眼黑头眩，风虚内做，非天麻不能除”，故以两味药为君药。茯苓、白术健脾祛湿，以绝生痰之源；砂仁化湿行气；川芎、丹参活血化瘀、行气化滞；石菖蒲醒脑开窍、和胃化湿；陈皮理气化痰；白芷、荷叶、谷精草升阳开窍、清利头目；使以甘草和中调药[10]。纵观全方，风痰并治，标本兼顾，但以化痰息风治标为主，健脾祛湿治本为辅。Liu等[11]研究发现天麻素能够缓解亚急性期大脑缺血再灌注损伤，其机制可能与抑制炎症反应以及凋亡有关。此外，天麻素能够治疗脊髓损伤，其机制可能也与其抗氧化及抗炎特性有关：神经元特异性烯醇化酶(NSE)、白细胞介素-1β(IL-1β)、活性氧自由基(ROS)、MDA等抗炎因子明显提升，脊髓神经细胞线粒体SOD、GSH-Px、T-AOC明显下降[12-13]。李文君等[14]研究表明，天麻素能够降低血脑屏障的通透性，抑制局部炎症反应，从而改善MACO大鼠神经功能缺失。何珊珊等[15]研究发现，天麻素能够上调MCAO小鼠Doublecortin(DCX)的表达水平，调节海马神经元，进而减轻脑缺血再灌注损伤。本实验结果发现，与模型组比较，在大鼠缺血灌注后24 h，熄风化痰方能够降低血清中MDA水平、提高SOD、GSH-Px水平。提示熄风化痰方有显著的抗炎作用。现代药理研究证实，中药天麻的主要成分天麻素能够改善椎基底动脉供血不足，有效治疗前庭系统疾病，同时还能扩张血管，有效预防血栓形成，改善微循环，保护脑细胞，减轻缺血再灌注损伤，抑制凋亡等[16-20]。相关医学研究发现，熄风化痰活血饮通过上调缺血再灌注后脑组织神经细胞Bcl-2的表达而抑制神经细胞凋亡，起到脑保护作用[21]。本实验应用TTC染色法检测脑梗死面积，结果发现，与模型组相比较，在大鼠脑缺血再灌注后24 h，熄风化痰方能够减少大鼠脑组织梗死面积，也提示了熄风化痰方具有明显抑制凋亡的作用。

综上所述，熄风化痰方能够通过调节血MDA、SOD、GSH-Px、T-AOC水平，缓解神经元细胞及胶质细胞的病变，减少脑梗死面积，为临床治疗缺血性脑血管病提供了更好的用药途径。