克洛己新干混悬剂通过PI3K/AKT信号通路改善铜绿假单胞菌诱发的小鼠急性肺炎

李燕梅 郝金平 郭永林 程环

(1菏泽市立医院，山东 荷泽 274000；2菏泽市妇幼保健院)

铜绿假单胞菌(PA)因其生长过程中会产生绿色水溶性色素，使脓液呈现绿色，因此又称其为绿脓杆菌〔1〕。PA主要存在于人体的皮肤、呼吸道及消化道内，其生长条件要求较低，繁殖能力较强，因此会导致人体多系统、多部位和多脏器发生感染，严重时危及患者生命安全〔2〕。PA是造成肺炎的主要致病菌种，由该种病菌感染的肺炎致死率较高。PA肺炎是呼吸内科常见疾病，但因PA的膜通透性较高而对多种抗生素耐药，给临床治疗PA肺炎带来了很大的困难〔3〕。磷酸肌醇3激酶(PI3K)/AKT是细胞进行信号传导的重要途径，涉及炎症反应和免疫应答〔4〕。Yang等〔5〕研究表明抑制PI3K/AKT信号通路的激活可阻止甲型流感病毒感染后的肺炎链球菌再感染；Yu等〔6〕研究显示，广藿香醇通过抑制PI3K/AKT和细胞外调节蛋白激酶(ERK)/促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路抑制了甲型流感病毒的体外繁殖，同时通过鼻内给药可显著减轻肺炎小鼠的症状并提升肺炎小鼠的存活率。克洛己新干混悬剂是由盐酸溴己新和头孢克洛复合而成的新制剂，其在抗感染、抗菌的基础上进行化痰治疗。现阶段，克洛己新干混悬剂虽在临床上取得了较好的治疗效果，但对临床用药的安全性和其具体作用机制尚不清楚，因此本研究将在细胞水平上探究克洛己新干混悬剂的细胞毒性，并通过构建PA肺炎动物模型探究其治疗效果和作用机制。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂 60只雄性昆明小鼠，4周龄，体重(14.0±1.0)g，购于国家药品和生物制品控制研究所实验动物中心，其中对照组12只，模型组48只。NHBE、BEAS-2B和A549细胞系购自美国模式培养物研究所。克洛己新干混悬剂(编号：B14200032850，批准文号：国药准字H20051142)购自江苏正大清江制药有限公司。DMEM培养基、F12培养基、琼脂糖培养基、青霉素和链霉素及L-谷氨酰胺均购自美国Gibco公司。胎牛血清购自美国Thermo Scientific公司。人重组肿瘤坏死因子(TNF)-α细胞因子购自以色列PEPROTECH公司。PA标准株(ATCC27853)由菏泽市立医院检验中心提供。白细胞介素(IL)-6、IL-8、TNF-α和RANTES酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购自南京生航生物技术有限公司。PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和GAPDH一抗及HRP标记的IgG二抗均购自德国CST公司。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、RIPA裂解液和ECL试剂盒均购自碧云天生物技术公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 NHBE和BEAS-2B细胞在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基中培养。A549细胞置于含10%胎牛血清和2 mmol/L L-谷氨酰胺的F12培养基中培养。所有细胞置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中进行培养。

1.2.2细胞炎症模型构建 NHBE、BEAS-2B和A549细胞以2×106个/ml分别接种于25 cm2的培养瓶中，细胞贴壁融合>50%时更换新鲜培养基，加入10 ng/ml的TNF-α刺激2 h后收集细胞用于后续实验。

1.2.3四甲基偶氨唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力 取对数生长期的细胞用0.25%的胰酶消化后配制成细胞悬液(5×104个/ml)并接种至96孔板，每孔180 μl。孵育过夜后加入0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 mg/ml的克洛己新干溶液。培养24 h后向各孔中加入10 μl的MTT溶液(5 g/L)继续孵育4 h。弃除上清液后加入100 μl的DMSO振荡10 min。使用酶标仪测定各孔在490 nm处的吸光光度值，并计算细胞活性。

1.2.4PA肺炎小鼠模型构建 将标准菌株ATCC27853使用琼脂糖培养基调整浓度至0.5个麦氏单位(≈1.3×108CFU/ml)。切开模型组小鼠气管，注入含50 μl PA的琼脂糖珠悬液后立即竖起小鼠保持2 min，菌液充分流入肺后小鼠有类似呛咳反应。对照组小鼠制作切口不接种PA。1 w后小鼠伤口愈合后进行后续实验。本研究中所涉及的动物实验均符合美国国立卫生研究院关于对实验动物使用的指导原则。

1.2.5小鼠实验 对照组小鼠伤口愈合后收集静脉血，处死小鼠后收集小鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)。模型组小鼠接种PA 1 w后通过口服克洛己新干混悬剂，根据口服克洛己新干混悬剂的剂量分为低浓度组〔10 mg/(kg·d)〕、中浓度组〔30 mg/(kg·d)〕和高浓度组〔50 mg/(kg·d)〕。口服克洛己新干混悬剂10 d，收集小鼠静脉血后处死小鼠并收集肺组织和BALF。小鼠静脉血收集后存于-20℃用于后续实验。小鼠BALF收集后测量其体积。将收集的小鼠肺组织称重后置于80℃的恒温干燥箱中过夜，获取干燥的肺组织后称重。通过公式计算小鼠肺组织湿/干重比(湿/干重比=湿肺重量/干肺重量)。

1.2.6ELISA检测验证因子表达水平 向酶标板各孔中加入稀释后的IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES抗原100 μl，置于37℃下4 h。弃除上清液后使用5%胎牛血清封闭40 min。加入对应酶标抗体后在按照ELISA试剂盒说明书在450 nm处测定细胞、小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES吸光光度值，根据各因子的标准曲线计算其水平。

1.2.7HE染色检测小鼠肺组织病理学变化 将收集的小鼠肺组织使用预冷的4%多聚甲醛固定48 h后使用梯度浓度的酒精脱水，随后用石蜡进行包埋。将石蜡包埋后的组织进行切片(5 μm)后放置于载玻片上，在80℃的恒温干燥箱中过夜。使用二甲苯去除组织表面的石蜡后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3 次，切片使用苏木素染色液染色3 min后再使用伊红染色液染色3 min。将染色后的切片风干后使用中性树脂封片，显微镜下观察后拍照。

1.2.8Western印迹检测PI3K/AKT信号通路活性 使用RIPA裂解液提取细胞和小鼠肺组织中的总蛋白。将30 μg的蛋白质样品使用SDS-PAGE转移至硝酸纤维素膜上，在室温下使用脱脂奶粉封闭30 min。使用抗PI3K(1∶1 000)、抗p-PI3K(1∶1 000)、抗AKT(1∶1 000)、抗p-AKT(1∶1 000)和抗GAPDH(1∶1 000)在4℃条件下孵育过夜。孵育过夜后使用HRP标记的IgG抗体继续在室温条件下孵育1 h。通过ECL试剂盒显影后拍照，通过Imagej软件对条带灰度值进行测定。

1.3统计学处理 使用SPSS20.0软件进行t检验、方差分析。使用Graphpad Prism8.0软件对数据进行图片绘制。

2 结 果

2.1克洛己新干混悬剂对人肺细胞和PI3K/AKT信号通路影响 MTT结果显示，克洛己新干混悬剂浓度在0.1～3.0 mg/ml的浓度内对A549细胞未表现出明显的细胞毒性。通过TNF-α刺激A549细胞以诱导细胞产生炎症反应。ELISA结果显示，TNF-α诱导后细胞内IL-6和IL-8的表达水平相对于对照组显著上升(P<0.05)。高浓度组、中浓度组和低浓度组IL-6和IL-8水平均较TNF-α组明显降低(P<0.05)。Western印迹检测结果显示，TNF-α诱导后细胞内PI3K/AKT信号通路被激活(P<0.05)，高浓度组、中浓度组和低浓度组的克洛己新干混悬剂处理后细胞内PI3K/AKT信号通路的激活受到明显抑制(P<0.05)，见表1、图1。

图1 Western印迹检测克洛己新干混悬剂对PI3K/AKT信号通路影响

表1 各组IL-6、IL-8水平比较

2.2PI3K/AKT信号通路对人肺细胞炎症的影响 与TNF-α组相比，TNF-α+LY294002组p-PI3K、p-AKT信号通路蛋白显著降低(均P<0.05)。见图2，表2。表明使用LY294002后A549细胞内IL-6和IL-8水平明显降低。

图2 Western印迹检测PI3K/AKT信号通路对人肺细胞炎症的影响

表2 抑制PI3K/AKT信号通路对人肺细胞PI3K/AKT信号通路蛋白的影响

2.3克洛己新干混悬剂对PA肺炎小鼠肺部炎症和肺水肿的影响 HE染色结果显示，接种PA后模型组小鼠肺组织中观察到明显的脓性渗出物，中浓度组、高浓度组克洛己新干混悬剂给药10 d后可明显减少PA肺炎小鼠肺组织的脓性渗出物，低浓度组克洛己新干混悬剂给药并未表现出这种效果，见图3。TNF-α组BLAF体积、湿重/干重、IL-6、IL-8、TNF-α、RANTES水平均显著高于对照组(均P<0.05)；低、中、高浓度组上述指标水平均显著低于TNF-α组，且至浓度依赖性(均P<0.05)。见表3。

图3 各组肺组织的病理学观察(HE，×40)

表3 各组肺部炎症和肺水肿影响指标水平比较

2.4克洛己新干混悬剂对PA肺炎小鼠PI3K/AKT信号通路活性的影响 TNF-α组p-PI3K和p-AKT水平显著高于对照组(P<0.05);与TNF-α组相比，低浓度组、中浓度组、高浓度组p-PI3K和p-AKT水平显著降低，且呈剂量依赖性(均P<0.05)，见表4，图4。

表4 克洛己新干混悬剂对PA肺炎小鼠PI3K/AKT信号通路蛋白的影响

图4 克洛己新干混悬剂对PA肺炎小鼠PI3K/AKT信号通路活性的影响

3 讨 论

研究表明，PA是院内感染的主要病原体之一，其外毒素会抑制蛋白质的合成，促使组织坏死，并引起白细胞减少、酸中毒、循环衰竭等，常发生在免疫力较为低下的人群中，同时也是造成肺炎的主要致病菌种〔7〕。同时PA诱发的肺炎是一个急性炎症反应，会导致肺损伤和一系列呼吸系统损伤，严重时可危及患者生命〔8〕。

PI3K/AKT信号通路在多种癌症中发挥促癌作用〔9〕，在多种慢性疾病中发挥促炎作用〔10，11〕。研究显示，miR-4485通过PI3K/AKT/mTOR途径改善了H1N1诱发的肺部损伤〔12〕，另外Psg-1的缺乏会导致PI3K/AKT信号通路激活诱发小鼠肺炎〔13〕。本研究结果表明PI3K/AKT信号通路参与了肺部细胞的炎症反应。有研究表明，PA的鞭毛运动能够激活PI3K/AKT信号通路的激活，提示PI3K/AKT信号通路可能是PA诱发肺炎的重要途径〔14〕。本研究表明克洛己新干可能通过PI3K/AKT信号通路减轻PA诱导的肺炎小鼠的肺损伤。

临床药理学研究表明，服用克洛己新干混悬剂后可能对消化道、肝脏和神经系统等产生一定的副作用〔15〕。但由于本研究实验室条件和时间限制，没有研究口服克洛己新干混悬剂对小鼠的肝功能和消化系统功能的影响，因此在后续的研究中我们将着重探究克洛己新干混悬剂对小鼠肝功能和消化系统功能的影响。综上，克洛己新干混悬剂可通过PI3K/AKT途径在体外有效抑制炎症细胞中炎症因子的表达，也可通过PI3K/AKT途径显著降低PA肺炎小鼠的肺损伤和肺水肿情况，并显著抑制PA肺炎小鼠血清炎症因子的表达。