基于Akt/PPARγ通路探讨培本固疏方通过促成骨干预绝经后骨质疏松症的机制

沈沐瑶，李佳洋，孙菁，王婧萤，王馨诣，郭海英*，徐道明，朱媛媛

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210033；2.盐城市第一人民医院，江苏 盐城 224041；3.江苏省中医院，江苏 南京 210029；4.南通市第六人民医院，江苏 南通 226001）

绝经后骨质疏松症（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一种全身性的慢性骨骼疾病，对患者有巨大的负面影响。该病所用治疗药物主要分为抑制骨吸收剂与促进骨形成剂［1］，目前临床治疗与科学研究主要集中于减少骨破坏，市面上大多药物也属于骨吸收抑制剂［2］，而对于促进骨形成的相关研究较少［3－7］。大量临床试验证明，中医药治疗PMOP 具有较好的应用前景，因此研究其治疗PMOP 的机制，尤其是通过促进骨形成治疗PMOP的作用机制有重大意义。

丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）是一种主要表达在细胞质内的蛋白激酶。目前Akt 的研究重点主要在于脂肪形成，另有研究证实，Akt 亦可以通过影响下游因子PPARγ 的表达，进而调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）成脂作用以促进成骨。因而研究Akt 及其下游关键因子PPARγ，对于研究PMOP 的治疗，尤其是通过促成骨治疗PMOP有重要意义。

本课题组前期研究发现，培本固疏方（PBGSF）可以调控破骨细胞，本实验着重研究PBGSF 通过促进成骨干预PMOP 的具体作用机制，以期进一步探索完善PBGSF防治PMOP的有效途径，从促成骨角度为PMOP的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

6月龄SPF 级（300 ± 30）g 健康雌性未孕大鼠36 只（上海西普尔－必凯实验动物有限公司），许可证号：SCXK（沪）2018－0006。饲养于南京中医药大学动物实验中心，室温（22± 2）℃，湿度40%～60%。本实验过程由南京中医药大学动物实验伦理委员会监督（伦理号：201905A022）。

1.1.2 实验药物

培本固疏方由龟甲、鹿角片、人参、仙桃草按2∶2∶3∶4 配伍（所有药材购于南京中医药大学百草堂药房），龟甲打碎先煎30 min，加入鹿角片、仙桃草煎煮20 min，过滤煎液，人参单煎30 min 后取汁与前煎液混合，分别浓缩为低、中、高剂量（生药含量分别为1、2、4 g/mL）冷藏备用。

1.1.3 实验试剂与设备

1.1.3.1 主要试剂

活性氧（ROS）ELISA 试剂盒（南京翼飞雪生物科技，YFXER00746）；碱性磷酸酶（ALP）ELISA 试剂盒（南京翼飞雪生物科技，YFXER00084－1）；无水乙醇（上海中试化工总公司，2010072312）；二甲苯（济南汇丰达化工有限公司，9024300）；二抗（Broad Spectrum，85－9043）；DAB 试剂盒（上海生工生物工程有限公司，PW017）；盐酸（国药集团化学试剂有限公司，2016082214）；氨水（国药集团化学试剂有限公司，2016093226）；中性树胶（国药集团化学试剂有限公司，2016073021）。

1.1.3.2 主要设备与仪器

脱水机（武汉俊杰电子有限公司，JJ－12J）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司，JB－P5）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，RM2016）；冻台（武汉俊杰电子有限公司，JB－L5）；组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，KD－P）；烤箱（上海慧泰仪器制造有限公司，DHG－9140A）；载玻片及盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司，10212432C）；正置光学显微镜（日本尼康，NIKONECLIPSE CI）；成像系统（日本尼康，NIKON DS－U3）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组

将全部大鼠随机分为假手术组、模型组、PBGSF低剂量组（低剂量组）、PBGSF 中剂量组（中剂量组）、PBGSF高剂量组（高剂量组）和西药组。在自然光条件下分笼饲养，控制室温（22 ± 2）℃，相对湿度40%～60%。

1.2.2 模型建立

进行1 周的适应性饲养后，采用摘除双侧性腺（卵巢）的方法建立绝经后骨质疏松大鼠模型。造模前禁食1 d，饮水正常，术前采用腹腔注射10%水合氯醛溶液（300 mg/kg）对大鼠进行麻醉。造模后7 d 内，各组大鼠均经后肢肌注青霉素8 万U/d 防感染，4 周后经骨密度检测验证造模是否成功。

1.2.3 给药

各组大鼠自由饮食、自然光照，每周称重1 次。造模1 个月后。按等效剂量比率计算各治疗组大鼠的给药剂量并开始灌胃给药，每日1次，持续8周，给药容积0.5 mL/100 g，给药前将药剂隔水加热。低、中、高剂量组分别给予相应生药含量的培本固疏方；西药组给予阿仑膦酸钠0.1 mg/100 g；模型组和假手术组给予生理盐水0.5 mL/100 g。

1.3 指标检测

大鼠末次给药结束禁食1 d 后取材，使用10%水合氯醛溶液经腹腔注射（300 mg/kg）对大鼠进行麻醉，后右心室抽血处死。取适量试管并标记组别，仔细快速分离大鼠双后肢胫骨，置于－80 ℃的冰箱保存，用于Western Blot 检测；取大鼠股骨组织固定于甲醛溶液，用于骨应力检测和茜素红染色；采集大鼠血液保存，用于ELISA检测。

将待测大鼠胫骨置于MEDIX－90 双能X 线骨密度仪中，扫描得到高分辨率的图像，经软件分析测定获得大鼠胫骨骨密度值（BMD）。用生物力学测试仪进行试验，检测骨应力：将取得的股骨标本置于仪器测试口，调整支点使得压力锤停留于骨标本正中，调整跨距以及加载速度至骨标本断裂，记录弹性位移、极限位移和脆性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件对实验结果进行分析，实验数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05代表差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 培本固疏方对去势大鼠BMD的影响

与假手术组比较，模型组胫骨BMD 显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，低剂量组BMD上升，但结果不具有统计学意义；中剂量组BMD显著增高（P＜0.05），高剂量组、西药组BMD 增高十分显著（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠胫骨BMD情况比较（±s）

表1 各组大鼠胫骨BMD情况比较（±s）

注：与假手术组比较，##P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

骨密度（g/cm2）0.162±0.037 0.096±0.013##0.125±0.023 0.130±0.018*0.142±0.023**0.149±0.029**组别假手术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组n6 6 6 6 6 6

2.2 培本固疏方对去势大鼠骨应力的影响

与假手术组相比，模型组大鼠股骨组织弹性位移、极限位移明显低于假手术组（P＜0.01），股骨组织脆性升高（P＜0.05）。与模型组比较，低剂量组极限位移显著增高，脆性显著降低（P＜0.01），弹性位移有所增高，但结果不具有统计学意义；中剂量组极限位移显著增高，脆性显著降低（P＜0.01），弹性位移结果不具有统计学意义；高剂量组、西药组弹性位移、极限位移增高均十分显著（P＜0.01），西药组脆性降低（P＜0.05），而高剂量组脆性降低更明显（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠骨生物力学指标的比较（±s，n=6）

表2 各组大鼠骨生物力学指标的比较（±s，n=6）

注：与假手术组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

脆性（mm）0.293±0.079 0.168±0.061#0.287±0.071**0.292±0.077**0.227±0.060*0.270±0.042*组别假手术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组弹性位移（mm）0.737±0.120 0.337±0.074##0.304±0.072 0.391±0.079 0.533±0.073**0.571±0.046**极限位移（mm）1.030±0.087 0.505±0.047##0.591±0.035**0.683±0.013**0.760±0.017**0.841±0.015**

2.3 培本固疏方对去势大鼠骨组织形态学的影响

用茜素红（ARS）染色评估OB 矿化程度。与假手术组比较，模型组骨组织未出现钙化现象。与模型组比较，低、中、高剂量组骨组织钙化结节数量及钙沉积现象与浓度正相关，西药组亦可见大量钙化结节和钙沉积。见图1。

图1 大鼠股骨组织的形态学观察

2.4 培本固疏方对去势大鼠血清碱性磷酸酶（ALP）的影响

与假手术组相比，模型组大鼠血清ALP 显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量组与西药组大鼠血清ALP 均明显降低（P＜0.01），其中中药组效应具有浓度依赖性。见表3、图2。

表3 各组大鼠ALP水平比较（±s）

表3 各组大鼠ALP水平比较（±s）

注：与假手术组比较，##P ＜0.01；与模型组比较，**P ＜0.01。

组别假手术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组ALP（ng/L）33.797±8.170 135.557±11.510##84.677±6.722**71.726±13.135**49.523±13.135**32.872±9.288**n6 6 6 6 6 6

图2 各组大鼠ALP水平比较

2.5 培本固疏方对去势大鼠血清活性（ROS）水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠ROS 显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，低、中、高剂量组与西药组大鼠ROS 均明显降低（P＜0.01），且中药组效应具有浓度依赖性。见表4、图3。

表4 各组大鼠氧化应激指标ROS情况比较（±s）

表4 各组大鼠氧化应激指标ROS情况比较（±s）

注：与假手术组比较，##P ＜0.01；与模型组比较，**P ＜0.01。

ROS（IU/mL）51.536±4.403 185.322±8.309##104.763±15.154**66.162±5.434**50.817±2.972**48.180±2.118**组别假手术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组西药组n6 6 6 6 6 6

图3 各组大鼠ROS水平比较

2.6 培本固疏方对去势大鼠Akt/PPARγ 蛋白表达水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠Akt 蛋白表达水平显著降低，PPARγ 蛋白的表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，低剂量组PPARγ 蛋白的表达水平明显降低（P＜0.01），Akt 蛋白表达水平增高，但结果不具有统计学意义；中剂量组Akt 蛋白表达水平增高（P＜0.05），PPARγ 蛋白的表达水平降低（P＜0.01）；高剂量组、西药组Akt 蛋白表达水平显著增高，PPARγ蛋白的表达水平显著降低（P＜0.01）。见图4、图5、图6。

图4 各组大鼠骨组织中碱性磷酸化的Akt蛋白表达情况比较

图5 各组大鼠骨组织中PPAR－γ蛋白表达情况比较

图6 各组大鼠骨组织Akt/PPARγ蛋白表达量比较

3 讨论

文献表明，卵巢摘除法是目前普遍用于构建绝经后骨质疏松大鼠模型的造模方法，Sprague－Dawley 和Wistar 大鼠是最常用的品系［8］。骨质疏松研究的大鼠最小年龄应为6 个月，故本次实验选用6 个月大小的SPF 级健康、雌性未孕大鼠，造模结束4 周后经骨密度检测验证造模成功，后持续干预给药8周。

骨密度为目前公认的诊断绝经后骨质疏松症的金指标［9］，而双能X 线骨密度检测（DEXA）更是临床用于评判骨质疏松程度及疗效的金指标［10］。现代研究表明，骨质疏松常伴有明显骨生物力学改变［11］，因此通过研究骨应力变化，可以在一定程度上反应骨质疏松水平。骨代谢指标的变化先于骨密度，对于骨量的丢失可以起到一定的预测作用，相比较于单独测定骨密度，进一步测定骨代谢的生化指标可以更为及时地反映骨重建的动态。

PMOP 是由于激素水平下降等因素，导致绝经后妇女骨重塑破坏所形成的疾病［12－13］。骨形成减少的具体原因在于骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化减少以致成骨细胞生成减少，以及氧化应激反应等各种原因导致的成骨细胞凋亡加剧。为了评估培本固疏方对成骨细胞的影响，应当从骨细胞生成的细胞增殖、基质成熟和矿化三个阶段分析［14－15］。现代研究表明，茜素红（ARS）染色阳性提示成骨细胞矿化成功，各治疗组和假手术组ARS 染色均呈阳性，可见大量密集的钙化结节和钙沉积，且低、中、高剂量组骨组织钙化结节数量及钙沉积现象与浓度正相关，提示培本固疏方可以以剂量依赖的方式促进成骨细胞矿化成熟。此外，碱性磷酸酶（ALP）在骨形成中也起着重要的作用［16－17］，模型组血清中ALP 含量上升，各治疗组经治疗后ALP含量下降，提示培本固疏方可以通过调整血清中ALP水平介导PMOP的治疗。

丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）又称蛋白激酶B，是一种主要表达在细胞质内的蛋白激酶［18］，与骨形成密切相关，具体表现为诱导BMSCs成骨、促进成骨细胞成熟以及抑制骨细胞凋亡三个方面。PPARγ 是Akt 信号通路下游的关键影响因子，由细胞内脂质激活，是脂肪细胞分化的重要转录因子，对维持脂质稳态和抗氧化/抗炎反应至关重要［19］。PPARγ可以上调BMSCs 成脂作用［20］，进而抑制BMSCs 成骨作用，间接调控成骨细胞的分化和骨形成。Akt/PPARγ通路是调控成骨细胞增殖分化凋亡的关键通路，这一途径可被生长因子和其他细胞外信号激活。在成骨细胞分化和发挥功能的所有阶段都需要Akt 活性［21］，但可能在成骨分化细胞的过程中存在包括PPARγ 在内的几个不同的Akt 靶标，这些靶标控制着成骨细胞发育和功能的不同方面［22］，具体如下：

1）Akt/PPARγ 信号通路可以诱导BMSCs 成骨。Akt 本身关系到脂肪形成［23］，有研究表明，在不存在Akt的情况下，脂肪细胞分化受到抑制［24］。当Akt通路受到抑制时，通路下游关键因子GSK－3β 和βcatenin 表达上调。现代研究表明，β－catenin 的高表达可以提高BMSCs 成骨分化，而β－catenin 的失活则会导致体内外成骨分化的降低［25］。GSK－3β 失活可以诱导细胞溶质积累，使得β－catenin 易位至细胞核，激活靶基因PPARγ 致其表达上调［26－28］，从而导致脂肪细胞分化，并通过调控BMSCs 成脂作用间接调节成骨细胞分化，影响骨形成。因此，通过Akt通路调控下游关键因子GSK－3β和β－catenin，抑制下游PPARγ表达对于增加BMSC 成骨分化是本课题组自拟方干预PMOP的可能机制。

2）激活Akt/PPARγ 信号通路亦可以促进成骨细胞成熟，机制与Akt 信号通路及其下游关键因子Forkhead 转录因子（FoxO）有关［29］。FoxO3 为FoxO 家族的主要分子，在软骨细胞和成骨细胞中高度表达，是Akt信号通路的重要底物［30］。研究表明，FoxO3的缺失会强烈影响成骨细胞的功能［31－34］。活化的Akt 可以磷酸化FoxO，通过保持其在细胞质中的停留来控制其转录活性，通过调节FoxO3 来影响骨形成和成骨细胞存活，同时可以与骨形态发生蛋白2（BMP2）协同介导BMSCs的成骨细胞分化［35］。

3）Akt/PPARγ 信号通路可以控制成骨细胞凋亡，其主要机制与下游骨形成正调控因子FoxO1 有关［36］。氧化应激条件下，活性氧可以通过激活Akt/PPARγ 通路，上调下游关键因子Nrf－2［37］表达，以Nrf－2依赖性方式上调HO－1［38－39］表达，抑制细胞凋亡达到其促成骨作用。

以上理论研究得出，激活Akt 通路抑制下游关键因子PPARγ 表达，增加成骨细胞分化成熟，减少其凋亡，是本方干预PMOP 的可能机制。本试验表明，本方可以增加Akt表达，降低PPARγ的表达，这与本方临床有效性以及对其促成骨作用的猜想相一致。

中医学认为，骨质疏松症的病机多为脾肾不足，气滞血瘀，治法上常考虑补益脾肾、活血祛瘀。培本固疏方由郭海英教授根据长期临床经验拟定，药物组成为龟甲、鹿角、人参和仙桃草。其中人参为君药，固本培元、补脾益气，以复血瘀日久所致的元气虚弱，同时补益后天之本，促进水谷精微的运化，充养骨髓；龟甲、鹿角共为臣药，补益先天，使肾精得复，同时又能温补肾阳，助推气血运行；仙桃草为使药，借君药人参补气之力行活血之功，祛陈除瘀，使血瘀得复而骨骼得养。现代研究亦证实，本方中君药人参含有大量人参皂苷，人参皂苷Rb1 可显著提高成骨细胞的成活率和调控ALP，抑制氧化应激，减少ROS，加强骨生成，防治骨质疏松［40］；臣药鹿角片补益肾阳，适宜浓度的鹿角多肽对BMSCs具有良好的促进作用，可以促进BMSCs 增殖；仙桃草化瘀通络止痛，其有效成分槲皮素能够清除体内ROS，维持骨稳态，绿叶酸亦能够促进BMSCs 增殖和诱导其成骨。临床症状方面，PMOP 常伴随潮热、出汗、心痛、失眠等症状，这与老年女性的肾阴虚症状相似［5］。张介宾曾云：“善补阴者，必于阳中求阴，则阴得阳升而泉源不竭”，方中龟甲亦可以发挥雌激素替代作用，防止绝经后妇女骨质流失，治疗PMOP。

4 总结

通过对本实验结果的分析，可以得出以下结论：

1）培本固疏方能提高BMD，减少骨脆性，增加骨弹性，上调血清中Akt的表达水平，降低ALP、PPARγ的表达，减少细胞氧化应激，说明该方能有效改善绝经后骨质疏松，且疗效在一定程度上具有剂量依赖性。

2）培本固疏方可以作用于成骨细胞，主要通过发挥促成骨作用、促进成骨细胞增殖分化以及抗氧化应激减少成骨细胞凋亡防治绝经后骨质疏松症。

3）培本固疏方能调控Akt/PPARγ 信号通路，防治绝经后骨质疏松症。具体机制可能为：①通过Akt 信号通路直接作用于成骨细胞，促进成骨、骨矿化以及成骨细胞增殖分化全过程；②通过调控Akt 信号通路下游关键因子PPARγ，降低PPARγ 的表达水平，进而抑制BMSCs 成脂分化，从而间接调节成骨细胞的增殖和促进骨形成。

本研究通过对培本固疏方干预绝经后骨质疏松症模型大鼠骨相关指标进行检测，发现本方防治绝经后骨质疏松症可能与Akt/PPARγ信号通路激活影响骨形成有关。目前，中草药作用于成骨细胞影响骨形成的研究较少，本研究限于时间和能力，虽基于前期研究结果进一步探索发现了培本固疏方调控骨形成可能的上游关键因子PPARγ 以及Akt 信号通路，但研究工作亦较为粗浅，仅为后续实验提出可能性假说。日后若深入探究培本固疏方通过促成骨作用调控骨量这一途径，仍需继续探索本方是否通过其他通路影响骨形成，或本方通过调控Akt 信号通路后又影响哪些因子进而调节骨形成。且在文献研究时发现，本方内基本药物作用途径似乎与交感神经系统调控骨量有关，仍有待今后进一步学习和探究。