鹅肌肽对高尿酸血症大鼠的干预作用研究

张雅琴 张召锋 张维 苏米亚·艾合买提江 叶晨 买热排提·哈力木拉提

作者简介：张雅琴（1994—），女，在读硕士研究生，研究方向：营养与疾病。

通信作者：张召锋（1978—），男，博士，副教授，研究方向：营养与疾病、肠道菌群与慢性病。

摘要：目的：探讨鹅肌肽对高尿酸血症大鼠的作用及其机制。方法：选用雄性SD大鼠60只，随机分为6组：空白对照组（CON）、高尿酸血症组（HUA）、别嘌呤醇组[Allo：10 mg/（kg·d）]和鹅肌肽干预组[Ans 1 mg：1 mg/（kg·d）];[Ans 10 mg：10 mg/（kg·d）];[Ans 100 mg：100 mg/（kg·d）]，空白对照组喂养普通大鼠饲料，其他5组均喂养高尿酸血症模型饲料，进行相应物质的灌胃，实验周期为6周，实验结束后，收集大鼠24 h尿量，评价大鼠尿酸和肾功能指标，并进行肾脏组织学观察。结果：与CON组相比，HUA组血尿酸水平显著升高（P<0.05），血尿素氮、尿量及尿酸排泄指标均有显著性差异（P< 0.05）。与HUA组相比，鹅肌肽干预组中，Ans 10 mg和Ans 100 mg组的血尿酸水平降低（P< 0.05），尿量及尿酸排泄指标有显著性差异（P< 0.05），Ans 1 mg的胱抑素C和Ans 100 mg的血清腺苷脱氨酶显著降低（P< 0.05）。组织学分析显示，鹅肌肽各干预组大鼠管腔扩张和肾小管上皮细胞空泡变性明显改善，无纤维化，与空白对照组差异较小，能明显延缓高尿酸血症大鼠的肾脏损伤。结论：鹅肌肽能降低高尿酸血症大鼠尿酸水平，可能是通过促进肾脏尿酸排泄和保护肾功能来实现的。

关键词：高尿酸血症;鹅肌肽;尿酸;排泄率

近年来，随着人们饮食结构和生活方式的不断改变，高尿酸血症的患病率迅速上升并逐渐趋向低龄化[1-2]。高尿酸血症不仅会增加痛风的发病风险，还会增加糖尿病[3]、心血管疾病[4]、肾脏疾病[5]等多种疾病的患病风险。然而，目前的药物治疗虽然降低尿酸效果明显，但在长期使用过程中会产生如进行性肾功能衰竭、严重肝毒性[6-8]等副作用。咪唑类化合物（如鹅肌肽、L-组氨酸等）在脊椎动物的肌肉和大脑中高浓度存在[9]，其中，鹅肌肽（β-丙氨酰-1-甲基L-组氨酸）为多功能高度稳定的水溶性组氨酸二肽[10]，主要是从金枪鱼或鲣鱼中提取获得。鹅肌肽具有强大的排酸抗氧化功能[11-14]，但目前鹅肌肽对高尿酸血症研究仅限于在斑马鱼中，对高尿酸血症的作用机制仍不明确。因此，本研究拟通过建立高尿酸血症大鼠模型，观察鹅肌肽对高尿酸血症模型大鼠的干预作用，旨在为研究高尿酸血症的防治提供科学依据。

1材料与方法

1.1实验动物

选择6～8 w龄雄性清洁级SD大鼠60只，体重（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号：SCXK（京）2016-0006，饲于北京大学医学部SPF级动物饲养室，实验开始前用普通饲料进行适应性饲养1 w。

1.2造模材料及干预物质

4%氧嗪酸钾联合20%的酵母制成的高尿酸血症造模饲料，购于北京博泰宏达生物技术有限公司。鹅肌肽：淡黄色粉末，一般从金枪鱼等海鱼或者鸟肌肉中分离提取获得，购自国药集团星沙制药有限公司。黄嘌呤氧化酶、腺苷脱氨酶测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所有限公司。别嘌呤醇：白色粉末，分子量为120（本项目研究中的别嘌呤醇纯度为98%，购自北京百灵威科技有限公司）。

1.3动物分组、造模及干预

适应性喂养1 w后，利用随机数字表法将60只大鼠随机分为6组，每组10只。分别为：空白对照组（CON）、高尿酸血症组（HUA）、别嘌呤醇组（Allo）和鹅肌肽干预组（Ans 1 mg、10 mg、100 mg）。空白对照组给予普通大鼠饲料喂养，其他5组给予高尿酸血症造模饲料喂养;Allo组大鼠给予10 mg/（kg·d）的别嘌呤醇灌胃，Ans 1 mg、Ans 10 mg、Ans 100 mg组分别给予1、10、100 mg/（kg·d）的鹅肌肽溶液灌胃，所有大鼠均自由饮水和进食，干预喂养6 w。

1.4样品收集及指标测定

1.4.1大鼠血清和尿液中尿酸、肌酐和尿素氮浓度的测定实验结束时，大鼠禁食12 h，经股动脉采血5 mL。静置凝血30 min以上，使用离心机在4 ℃条件下以3 000 r/min的转速离心5 min，再取300 μL血清，使用全自动生化分析仪来测定血清尿酸（SUA）、血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）、血清胱抑素C水平。饲养结束后，将大鼠放置在代谢笼中，收集24 h的尿液，测量尿液体积，并测定尿尿酸（UUA）、尿肌酐（UCr）的值。

尿中尿酸清除率（CUA）、肌酐清除率（CCR）的计算方法如式（1）、（2）：

CUA=UUA/SUA×尿量（mL/min）（1）

CCR=UCr/SCr×尿量（mL/min）（2）

1.4.2血清及肝脏黄嘌呤氧化酶（XOD）、血清腺苷脱氨酶（ADA）活性测定取100 μL血清测定黄嘌呤氧化酶（XOD）活性，取50 μL血清，测定腺苷脱氨酶（ADA）活性。摘取各组大鼠肝脏，准确称取1 g，加入0.9%生理盐水制成10%肝勻浆，以3 000 r/min的转速离心10 min。取100 μL上清液，利用比色法测定肝脏XOD活性。

1.4.3肾脏组织学观察实验结束后，处死大鼠，取大鼠右肾，用4%多聚甲醛固定，然后将肾脏组织包埋于石蜡切片中，制成3 μm切片，用苏木精和伊红染色，最后将这些切片置于光镜（×400）下观察并拍照分析。

1.5统计学方法

实验结果用均数±标准差（±SD）表示。运用SPSS 25.0软件进行分析，数据先进行方差齐性分析，然后进行单因素方差分析;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，满足正态性或者方差齐性要求后进行统计;若变量转换后仍未达到要求，采用非参数检验进行统计，组间比较采用最小显著差异法（LSD），以P<0.05为差异显著性标准。

2结果与分析

2.1各组大鼠体重、进食量的变化

基线周各组大鼠體重无明显差异（P>0.05），干预6 w后，与空白对照组相比，高尿酸血症组体重明显下降，别嘌呤醇组体重和高尿酸血症组差异不大，鹅肌肽各干预组（Ans 1、10、100 mg）体重与空白对照组差异不大。实验期间各组大鼠进食量均无明显差异（P>0.05），提示鹅肌肽对高尿酸血症大鼠的体重和进食量没有影响（表1）。

2.2各组大鼠血清尿酸、尿素氮、肌酐水平的变化

到实验第6周末，与空白对照组相比，高尿酸血症组大鼠的血尿酸水平显著升高（P<0.05），显示造模成功。同时高尿酸血症组大鼠的血清尿素氮、肌酐水平与空白对照组相比显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。别嘌呤醇组、鹅肌肽1 mg、鹅肌肽10 mg、鹅肌肽100 mg组较高尿酸血症组都有一定程度的降低，其中，鹅肌肽10 mg组和鹅肌肽100 mg组降低最为明显，分别降低了21.8、20.7 μmol/L（P<0.05）。与高尿酸血症组相比，鹅肌肽各干预组大鼠血清尿素氮的水平无显著性差异，但各组大鼠的血清肌酐值较高尿酸血症组均降低，且鹅肌肽100 mg组血清肌酐降低的水平较高尿酸血症组有显著性差异（P<0.05）（表2）。

2.3各组大鼠尿酸排泄相关指标

到实验第6周末，与空白组相比，高尿酸血症组尿量减少，CUA、CCR均明显降低，且差异有统计学意义（P<0.05）。与高尿酸血症组相比，别嘌呤醇组尿量增加，CUA升高（P<0.05），鹅肌肽各干预组的尿量也明显增加（P<0.05），CUA、CCR均明显升高，且差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。

2.4各组大鼠血清中XOD、ADA活性、肝脏XOD活性及胱抑素C的值

到实验第6周末，与空白组相比，高尿酸血症组的血清XOD和血清ADA均升高（P<0.05），但胱抑素C和肝组织XOD并无显著性差异。与高尿酸血症组相比，鹅肌肽各干预组的血清和肝组织中的XOD的值均无显著性差异，别嘌呤醇组、鹅肌肽100 mg组的血清ADA值降低（P<0.05），鹅肌肽1 mg组的胱抑素C水平降低（P<0.05）（图1）。2.5大鼠肾脏组织的病理改变

空白对照组：大鼠肾脏结构正常，未见肾小管管腔扩张，且管腔清晰，肾小管上皮细胞形态饱满，排列整齐，无炎症及纤维化出现。与空白对照组相比，高尿酸血症组肾小管管腔明显扩张（箭头1），肾小管上皮细胞见空泡变性（箭头2），且排列杂乱，偶见炎性细胞浸润，未见纤维化。与高尿酸血症组相比，别嘌呤醇组肾小管管腔稍扩张，肾小管上皮细胞偶见空泡变性，排列较为整齐。鹅肌肽1 mg组肾小管管腔稍扩张，肾小管上皮细胞未空泡变性，排列较为整齐，但肾小管管腔间质内偶见成纤维细胞（箭头3）。鹅肌肽10 mg组、鹅肌肽100 mg组大鼠管腔扩张和肾小管上皮细胞空泡变性明显改善，无纤维化，与空白对照组差异较小（图2）。

3讨论

本研究观察了鹅肌肽对高尿酸血症大鼠血清尿酸水平及肾脏病理改变的影响，并从尿酸生成途径与排泄途径探究了鹅肌肽对高尿酸血症可能的影响机制。目前高尿酸模型造模方法众多，但单药物造模往往剂量各异，对高尿酸血症的观察周期较短，难以评判其长久稳定性[15]。而氧嗪酸钾作为尿酸酶抑制剂在高尿酸血症啮齿类动物联合造模中具有血清尿酸水平迅速升高、维持时间长、肾脏损伤程度较轻的优点[16]，故本研究采用了联合造模的方法以提高模型的成功率和稳定性。利用酵母膏（增加体内尿酸前体物质）和氧嗪酸钾（尿酸酶抑制剂）联合，在一定程度上能减少对肾功能的损伤[17-18]。实验进行6周后，高尿酸血症大鼠血清尿酸水平明显升高，与空白组有显著性差异。观察肾脏组织学切片，高尿酸血症组大鼠肾小管管腔扩张，上皮细胞空泡变性，肾脏损伤整体符合高尿酸血症大鼠肾脏病理损伤机制。

在本研究中，鹅肌肽各干预组血清尿酸水平较高尿酸血症组有显著下降，且与阳性对照组别嘌呤醇组相比，鹅肌肽10 mg组下降最为显著，提示鹅肌肽对高尿酸血症的干预效果可能与干预剂量有关，这与之前鹅肌肽和血清尿酸相关研究的结果一致[19-20]。然而，和之前研究不同的是，鹅肌肽各干预组的血清尿素氮及肌酐的下降并不明显，同时，鹅肌肽对高尿酸血症大鼠体内的黄嘌呤氧化酶活性未见显著影响。Noguchi等[21]分别用肌酐和鹅肌肽喂养Wistar大鼠1 w后，鹅肌肽组大鼠血清尿酸水平低于肌苷组（对照组）。芯片分析显示，与肌苷组相比，鹅肌肽组大鼠肝脏中次黄嘌呤磷酸核糖转移酶和乳酸脱氢酶的表达明显增加。次黄嘌呤磷酸核糖转移酶通过补救合成途径使次黄嘌呤转化为次黄嘌呤核苷酸和鸟嘌呤转化为鸟嘌呤核苷酸增加，最终导致尿酸的生成减少。初步推断，鹅肌肽并非通过抑制黄嘌呤氧化酶活性减少尿酸生成来降低血清尿酸水平。

经鹅肌肽干预后，大鼠尿量、尿酸及肌酐的清除率较高尿酸血症组显著增加，鹅肌肽100 mg组的胱抑素C水平与高尿酸血症组有统计学差异，这与之前的相关研究结果机制类似[22]。鹅肌肽具有良好的pH缓冲性能，可能通过影响体液的pH值，从而提高尿酸的溶解度，促进尿酸的排泄[23]。鹅肌肽等二肽还具有强大的抗氧化性能，不仅可以通过直接清除氧化应激产物，还能通过调节线粒体功能来减少氧化应激水平[24-26]。Masut[20]实验中就表明了，鹅肌肽可以通过调节质子缓冲容量调节尿液pH值来增加尿酸溶解和促进尿液排泄，最终降低尿酸水平。同时，肾脏组织学分析显示，与高尿酸血症组相比，鹅肌肽各干预组比别嘌呤醇组更能明显改善管腔扩张和肾小管上皮细胞空泡变性，延缓高尿酸血症大鼠的肾脏损伤。因此，结合本次实验的数据分析结果和目前现有的研究，鹅肌肽可能是通过补救合成途径来抑制尿酸生成，减少尿酸的重吸收以及增加尿酸的排泄，来达到降低尿酸水平，防治高尿酸血症的效果。

然而，目前关于鹅肌肽降尿酸作用的研究还不多见，在未来还需要进行更多的机制以及人群实验，以便更深入的明确鹅肌肽对高尿酸血症的作用效果。◇

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Effect of Anserine on Hyperuricemia Rats

ZHANG Ya-qin，ZHANG Zhao-feng，ZHANG Wei，SUMIYA·Aihemaitijiang，YE Chen，MAIREPAITI·Halimulati

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University/Beijings Key Laboratory of Food Safety Toxicology Research and Evaluation，Beijing 100191，China）

Abstract：Objective To study the mechanism of anserine on hyperuricemia rats.Method Totally 60 male SD rats were selected and randomly divided into 6 groups including：CON，HUA，Allo，Ans 1 mg，Ans 10 mg，Ans 100 mg.The blank control group was fed with diet of normal rats，all the others were fed hyperuricemia fodder，and the corresponding substances were given by gavage.After 6 weeks of the experiment，the urine volume of the rats was collected for 24 h.At the end of the experiment，the rats were sacrificed to evaluate the biochemical indexes of renal function and observe the kidney histology.Result At the end of the 6th week of the experiment，compared with CON group，the uric acid level of HUA group was significantly increased（P<0.05），and there were significant differences in blood urea nitrogen，urine volume and uric acid excretion indexes（P<0.05）.Compared with the HUA group，serum uric acid levels of Ans 10 mg and Ans 100 mg in anserine intervention group were decreased（P<0.05），urine volume and uric acid excretion indexes had significant differences（P<0.05），Ans 1 mg of cystatin C and Ans 100 mg of serum ADA were significantly reduced（P<0.05）.Histological analysis showed that the dilatation of lumen and vacuolar degeneration of renal tubular epithelial cells in the intervention groups were significantly improved，with no fibrosis and little difference from the blank control group，which could significantly delay the renal injury of hyperuricemia rats.Conclusion Anserine can reduce serum uric acid level and protect renal function by increasing urine volume and excretion of renal uric acid in rats.

Keywords：hyperuricemia;anserine;uric acid;discharge rate