基于RhoA/ROCK通路研究硫化氢对星形胶质细胞低氧损伤的影响

张 阳,丁延雨，文继月，陈志武

星形胶质细胞是神经系统中分布最广、数量最多的一类细胞，在生理状态下对神经元细胞起营养、支持和保护作用。在脑缺血损伤发生时，星形胶质细胞会发生形态、功能和基因表达的改变，促进神经系统损伤修复，调节星形胶质细胞功能是治疗缺血性脑损伤和促进神经修复的重要新方向。

硫化氢(hydrogen sulfide, HS)是机体内广泛存在的气体信号分子，主要由胱硫醚β合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)催化合成。Rho激酶(Rho kinase,ROCK)是小GTP酶Ras同源家族成员A(Ras homolog gene family member A,RhoA)的主要下游效应因子，包括Rho蛋白激酶1(ROCK)和Rho蛋白激酶2(ROCK)两种亚型。法舒地尔(Fasudil)是上市的ROCK抑制剂，被证明具有治疗脑梗死效果，改善神经功能的缺损。课题组前期研究表明，脑血管内皮细胞释放的HS通过抑制血管平滑肌RhoA/ROCK信号通路，发挥脑缺血损伤的血管保护作用。因此，该研究通过建立低氧培养星形胶质细胞损伤模型，观察HS对星形胶质细胞低氧损伤的影响，并初步探讨其作用和RhoA/ROCK通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠星形胶质细胞RA(BNCC337745)购自北京北纳创联生物技术研究院；硫氢化钠(NaHS)购自Sigma公司(批号：#SHBF1746V)；Fasudil购自阿拉丁试剂有限公司(批号：F122336)；Fluo-8钙离子荧光探针购自上海复申生物公司(批号：FS1222)；ROCK抗体(批号：ab125025)、ROCK抗体(批号：ab45171)、Ras同源家族成员A(RhoA)抗体均购自Abcam公司(批号：ab187027)；胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体购自Affinity公司(批号：DF6040)。

1.2 方法

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细胞培养 在恒温培养箱(37 ℃，5% CO)中，细胞在含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素的高葡萄糖DMEM培养基中培养，通过倒置显微镜观察，待细胞融合度达90%时进行传代培养，并分别加入测试药进行试验。……