miR-27a-3p靶向调控Yes相关蛋白1促进人牙髓干细胞成骨分化

王小娟，朱友明

组织工程技术是修复颌面部骨组织缺损的主要方法之一，种子细胞则是这项研究的核心，其中人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)在近几年备受关注。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种内源性的转录后调控因子，在细胞成骨分化过程中起着重要作用。研究表明miR-27a靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPAR-γ)和GREM1促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨，而其对hDPSCs成骨分化的影响尚无报道。Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP1)是肿瘤抑制通路Hippo信号通路中的一个核心分子，超激活后可调控细胞增殖、转移、生存、维持干细胞活性以及调控细胞成骨分化。Seo et al研究报道，转录因子SOX2-YAP1轴对骨髓间充质干细胞的成骨分化具有抑制作用，这可能与分泌型蛋白DKK1介导的YAP1/β-cantine对Wnt信号转导的破坏有关。预实验结果显示，miR-27a-3p在hDPSCs成骨分化后出现差异性上调，应用miRNA靶基因预测数据库(TargetScan)预测表明YAP1可能是其靶基因。该研究探讨了miR-27a-3p和YAP1在hDPSCs成骨分化过程中的调节作用，以期找到hDPSCs定向成骨分化的理想微环境，提高其作为种子细胞的应用价值。

1 材料与方法

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1 主要试剂

DMEM高糖培养基、无血清培养基opti-MEM、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；诱导成骨分化培养基购自美国Cyagen公司；miR-27a-3p模拟物(miR-27a-3p mimics)、miR-27a-3p抑制剂(miR-27a-3p inhibitor)、对照miR-NC均购自上海吉玛制药公司；pcDNA3.1质粒、Psi-vector质粒均购自上海生工生物工程公司；双荧光素酶报告基因检测试剂购自美国Promega公司； Lipofectamine2000、TRIzol购自美国Invitrogen公司；T4 DNA连接酶、逆转录试剂和qRT-PCR相关试剂均购自日本TAKARA公司；主要引物序列和抗体信息见表1、2。

表1 主要引物信息

表2 主要抗体信息

1.2 hDPSCs的分离和成骨诱导培养