人参皂苷Rh2对黑色素瘤B16细胞作用及机制研究

任 煜，刘婷婷，祁冰洁

(安庆医药高等专科学校，安徽 安庆 246052)

黑色素瘤是一种恶性的侵袭性肿瘤，黑色素瘤的发生率在所有皮肤癌中最低，但死亡率高[1]。具有高度恶化、预后差、易转移、对化疗药物不敏感等特点，给人类的生命健康带来极大的威胁[2]。人参皂苷Rh2(G-Rh2)是人参皂苷中抗肿瘤活性较强的物质之一，在治疗肝癌、结肠癌、肺癌及胃癌等方面都表现出药理作用[3]，但是在黑色素瘤的治疗上鲜少有人报道。本研究选用小鼠黑色素瘤细胞B16作为研究对象，考察G-Rh2对B16细胞的作用, 并初步探讨其中的机制，为进一步深入研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 小鼠B16黑色素瘤细胞(购自中国科学院上海细胞库)；G-Rh2(纯度>98%，购自成都曼思特生物科技有限公司)；DMEM高糖培养基、胰酶、双抗、PBS磷酸缓冲盐溶液(均购自上海碧云天科技有限公司)；胎牛血清、CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、DNA含量检测试剂盒、Bradford法蛋白浓度测定试剂盒、Caspase-3活性测定试剂盒、Caspase-9活性测定试剂盒(均购自上海索莱宝生物科技有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)。

1.1.2 仪器 二氧化碳培养箱(美国Thermo 公司)；倒置显微镜(日本Olympus 公司)；JW-2019HR高速冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；CytoFLEX流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；SpectraMax iD3多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将装有黑色素瘤B16细胞的冻存管从液氮中取出，迅速投入37 ℃水浴融化，来回晃动至细胞融化后尽快移出37 ℃水浴。然后置于离心机中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，加入适量的完全培养基重悬，把细胞悬液转入含有完全培养基的培养瓶中，放入CO2培养箱(37 ℃，5%CO2)培养，显微镜下密切观察细胞状态，1～2 d更换培养基，待细胞培养至融合率达到80%～90%后，弃去培养基，加入适量PBS清洗，加入胰蛋白酶消化传代培养。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖 取对数生长期的黑色素瘤B16细胞，在显微镜下进行细胞计数，将细胞的浓度调整为1×105个/mL，随后将细胞接种到96孔板中，每孔加入100 μL的细胞液，每孔细胞浓度为1×104个/孔，在培养箱过夜培养细胞，细胞贴壁生长后，弃上清，在96孔板中分别加入含药的100 μL新鲜完全培养基，药物的浓度分别为10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL，同时设有未加药的空白对照组，分别培养24 h、48 h、72 h，将96孔板中的培养液吸弃，加入含CCK-8的混合液(CCK-8试剂和完全培养液的体积稀释比例为1∶10)，37 ℃继续孵育1 h后，在酶联免疫检测仪波长450 nm处检测各孔的OD值，并计算细胞的增殖抑制率。实验重复6次。计算公式为：

增殖抑制率=[1-(药物组OD值-空白组OD值/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长的黑色素瘤B16细胞，用胰蛋白酶消化后，将细胞接种于6孔板中，在37 ℃，5% CO2的CO2培养箱中培养过夜。细胞贴壁生长后，弃培养基，PBS冲洗3次，更换含药的培养液继续培养，将其分5组：空白对照组、10 mg/mL组、20 mg/mL组、30 mg/mL组、40 mg/mL组。药物处理48 h后，用胰蛋白酶消化，PBS冲洗3次，然后加入1 mL冷PBS洗涤，轻轻震荡使细胞悬浮，1000 rpm，4 ℃离心5 min，弃上清，重复3次；将细胞悬浮于1 mL Binding Buffer，300 g离心10 min，弃上清，再用1 mL Binding Buffer重悬细胞，将细胞浓度调整为1×106个/mL；每管加入100 μL的细胞(1×105个/mL)，然后每管加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光反应10 min；5 μL PI，轻轻混匀，室温避光反应15 min，加400 μL Binding Buffer，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。实验重复3次。细胞凋亡率/%=早期凋亡率/%+晚期凋亡率/%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长的黑色素瘤B16细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，将细胞接种于6孔板中，在CO2培养箱中培养过夜，细胞贴壁生长后，弃培养基，PBS洗涤3次，更换含药的培养液继续培养，将其分5组：空白对照组、10 mg/mL组、20 mg/mL组、30 mg/mL组、40 mg/mL组。药物处理48 h后，细胞用胰蛋白酶消化，PBS洗涤3次，将细胞浓度调整为(1～5)×106个/mL，取1 mL的细胞悬液离心，1000 g，离心3min；弃上清，70%预冷酒精混匀，4 ℃固定12～24 h。1000 g，离心3 min，去上清，1 mL PBS洗涤1次，1000 g，离心3 min，去上清。加入0.5 mL碘化丙啶染色液(染色缓冲液、RNaseA、碘化丙啶染色液以500:25:2.5配制为碘化丙啶染色液)，37 ℃避光孵育30 min，4 ℃避光孵育30 min，用流式细胞术检测细胞周期的变化。实验重复3次。

1.2.5 分光光度法检测Caspase-3、Caspase-9活性 用显微镜对黑色素瘤B16细胞的生长情况进行观察，取对数生长的黑色素瘤B16细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，将其分5组：空白对照组、10 mg/mL组、20 mg/mL组、30 mg/mL组、40 mg/mL组。药物处理48 h后，用胰蛋白酶消化，将细胞浓度调整为(1～5)×106个/mL，300 g，离心5 min，去上清，用PBS重悬，300 g，离心3 min，加入Lysis Buffer，在冰上孵育15 min，10000 g，离心1 min，通过Bradford法定量蛋白质浓度，调整样品蛋白浓度为1.0 mg/mL。每组取50 μL的样品蛋白，加入Caspase-3或Caspase-9 Substrate，37 ℃避光孵育4 h，酶标仪检测405 nm的吸光度值。实验重复3次。用药物组与未加药对照组的吸光度(OD)值来表示不同浓度药物组Caspase-3和Caspase-9的活性。

1.3 统计学处理用SPSS 23.0软件对数据进行分析处理，用Graphpadprism 7进行做图。计量资料以“均数±标准差”来表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 G-Rh2对B16细胞增殖的影响不同浓度G-Rh2 (10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL)作用于B16细胞24 h、48 h和72 h后，与空白对照组比，随给药浓度升高和药物干预时间延长B16细胞的细胞活力均有显著降低，并且呈浓度依赖性和时间依赖性，见表1。可见，G-Rh2具有抗B16黑色素瘤细胞的潜在能力，值得进一步深入研究。

表1 在不同时间段下不同浓度G-Rh2作用于B16细胞的生长抑制率

2.2 G-Rh2对B16细胞凋亡的影响10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL的G-Rh2作用B16细胞48 h后，与对照组相比，G-Rh2的10 mg/mL组B16细胞凋亡率没有显著的差异(P>0.05)，G-Rh2的其他各组能显著诱导B16细胞凋亡，随着浓度的增加，细胞凋亡率也在增加(P<0.05)，呈浓度依赖性，具有统计学意义，见图1。明确了G-Rh2能够诱导B16黑色素瘤细胞凋亡。

图1 不同浓度的人参皂苷Rh2对B16细胞凋亡的影响

2.3 G-Rh2对B16细胞周期的影响10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL的G-Rh2作用B16细胞48 h后，不同浓度G-Rh2均可影响B16细胞生长周期，与空白对照组相比，G0/G1期细胞增多，由空白对照组60.64%增加至40 mg/mL时的82.88%，G2/M期细胞减少，由空白对照组16.31%下降至40 mg/mL时的7.49%，见表2、图2。G-Rh2诱导B16细胞周期阻滞于G0/G1期。随着G-Rh2浓度的增加，这种作用越显著，差异具有统计学意义。

表2 不同浓度G-Rh2作用下B16细胞48 h后细胞周期分布情况

图2 不同浓度G-Rh2作用于B16细胞48 h后细胞周期分布情况

2.4 G-Rh2对B16细胞Caspase-3、Caspase-9活性的影响随着G-Rh2浓度的上升，Caspase-3、Caspase-9活性均明显升高，且呈剂量依赖性，各组细胞中Caspase-3、Caspase-9活性与Control组比较差异均有统计学意义，见表3。表明G-Rh2能够活化Caspase-3和Caspase-9，从而参与细胞凋亡的发生。

表3 不同浓度G-Rh2作用B16细胞48 h后caspase-3，caspase-9活性

3 讨论

恶性黑色素瘤，多见于皮肤，是一种侵袭性很高的肿瘤，而且对于大多数传统的治疗方法都会产生抵抗能力。目前治疗黑色素瘤的方法众多,但其预后很差[4]，多数药物在治疗过程中反应率低且毒性非常显著，所以大多数常规化疗药物在黑色素瘤治疗中都失败[5]。因此，迫切需要寻找一些新的有效安全的黑色素瘤药物。

在20世纪60～70年代人们就已经发现并且认识到人参具有抗肿瘤的作用，能够抑制某些恶性肿瘤。随着大量的研究证明，人参中具有抗肿瘤作用的活性成分主要是人参皂苷类。人参皂苷主要存在于人参、三七等五加科人参属植物中，是一类固醇类化合物[6]。G-Rh2 是从人参中提取分离得到的二醇型低糖链皂苷单体, 它具有抗炎、抗肿瘤及降血糖作用等作用[7]，G-Rh2 对癌症患者病情的改善、生活质量的提高、生命的延长等都具有重要作用。G-Rh2对很多种肿瘤细胞都具有抑制作用，像肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌等。随着国内外研究的深入，学者发现G-Rh2主要是通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡分化；能够提高机体对肿瘤的免疫力，增强免疫活性；抵抗肿瘤细胞的转移与侵袭；抑制肿瘤血管的形成等[8]方面来产生抗肿瘤的作用。本实验运用CCK-8检测不同浓度的G-Rh2对B16细胞增殖的影响，结果显示，随G-Rh2浓度升高和G-Rh2干预时间延长，与空白对照组比，对B16细胞的抑制率均有显著升高，并且呈浓度依赖性和时间依赖性。表明G-Rh2能够抑制B16细胞增殖，说明G-Rh2具有抗B16黑色素瘤细胞的潜在能力。

诱导细胞凋亡是治疗肿瘤非常重要的途径之一，肿瘤细胞凋亡是为了维持内环境的稳定，由基因表达调控的细胞自主有序的死亡。有研究发现，肿瘤的发生、发展及转移都与肿瘤细胞凋亡有密切关系[9]。当细胞出现凋亡，它的细胞体积会缩小，细胞核的核质会发生浓缩、核仁碎裂、深染，凋亡小体等变化。本实验采用Annexin V-FITC/PI双染的方法，运用流式细胞术检测G-Rh2对B16细胞细胞凋亡的影响，与空白对照组相比，随着G-Rh2的浓度增加，B16细胞的凋亡率也升高，呈浓度依赖性。表明G-Rh2能够显著增加B16细胞的凋亡率，说明G-Rh2能够诱导B16黑色素瘤细胞凋亡。

细胞周期阻滞是诱导细胞死亡的机制之一，细胞的凋亡与其周期变化密切相关，细胞周期的全过程受到G1、S、G2、M等检查点的严格控制，当这些检查点发生改变就会导致细胞异常增殖，并且向癌症发生发展，这些检查点出现缺陷会导致肿瘤细胞无限增殖。很多抗肿瘤细胞能够在在特定的检测点诱导细胞周期阻滞，从而诱导细胞凋亡[10]。本实验采用流式细胞术检测G-Rh2对B16细胞细胞细胞周期的影响，不同浓度G-Rh2均可影响B16细胞生长周期，与空白对照组相比，G0/G1期细胞增多，G2/M期细胞减少，随着G-Rh2浓度的增加，这种作用越显著，表明G-Rh2诱导B16细胞周期阻滞于G0/G1期。

Caspase家族存在于细胞质的溶胶中，是一组结构相关的半胱氨基酸家族，也是促进凋亡的关键酶。大多数细胞凋亡通路都会汇合成一个可激活的Caspase的中心死亡信号，除少数非Caspase依赖性的通路[11]。Caspase家族中Caspase-9，Caspase-3在凋亡中具有重要的地位，Caspase-9是重要的启动分子，Caspase-9位于凋亡级联反应的上游，它可以自我活化或者与其他Caspase相互活化，激活下游的其他Caspase蛋白并且起着逐级放大作用，从而启动凋亡[12]。Caspase-3是重要的执行分子，当接受信号后启动凋亡。终末效应酶Caspase-3无论是哪一种途径都将被激活，产生一系列级联反应，促使细胞凋亡，所以说Caspase-3有“死亡蛋白酶”之称[13]。本实验采用分光光度法检测Caspase-9、Caspase-3蛋白的活性，结果发现，与空白对照组相比，随着G-Rh2浓度的升高，Caspase-9、Caspase-3活性也越来越高，且呈剂量依赖性。G-Rh2可能是通过激活Caspase家族，干预了Caspase-9、Caspase-3蛋白活性，促进了B16细胞的凋亡。

综上所述，G-Rh2可有效抑制黑色素瘤细胞B16的增殖，并且促进体外培养的黑色素瘤细胞B16凋亡，G-Rh2诱导B16细胞凋亡有可能与激活Caspase信号通路有关。这显示了G-Rh2在恶性黑色素瘤治疗中具有潜在应用价值，但G-Rh2诱导凋亡的具体途径以及药物作用的靶点仍有待深入探讨。