恩诺沙星对球等鞭金藻生长及脂肪酸的影响

许燕茹 林岗

摘 要：以球等鞭金藻Isochrysis galbana為研究对象，分析不同浓度恩诺沙星（ENR）处理下，球等鞭金藻的生长和脂肪酸组成变化。通过细胞计数法和分光光度法测定球等鞭金藻的生长变化，采用气相色谱法测定球等鞭金藻的脂肪酸组成和含量。结果表明：恩诺沙星对球等鞭金藻的生长表现出低促高抑的作用，当恩诺沙星处理浓度≤0.625 mg·L-1  时表现出促进作用，恩诺沙星处理浓度≥5 mg·L-1  时表现出抑制作用，但未体现浓度-效应关系。在恩诺沙星的胁迫下，球等鞭金藻脂肪酸组成和含量均发生变化;随着培养时间的增加，球等鞭金藻脂肪酸总含量呈降低趋势，当培养时间为24、96 h时，各浓度组不饱和脂肪酸含量均低于对照组（ENR浓度为0 mg·L-1  ），DHA含量与对照组差异不显著;当恩诺沙星处理浓度≥5 mg·L-1  ，培养时间为240 h时，球等鞭金藻不饱和脂肪酸含量极显著高于对照组，DHA含量显著高于对照组。因此，在恩诺沙星胁迫下，球等鞭金藻中的不饱和脂肪酸占比得以提高。

关键词：球等鞭金藻;恩诺沙星;脂肪酸;胁迫

中图分类号：S 917.3 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2021）09-0008-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.09.002

Effects of Enrofloxacin on the Growth and Fatty Acids of Isochrysis Galbana

XU Yan ru 1， LIN Gang

（1. College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China; 2. Fujian Key Laboratory

of Sustainable Utilization of Featured Marine Biological Resources， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： In this study， by taking Isochrysis galbana as the research object， the growth and the changes of fatty acid composition of Isochrysis galbana were analyzed under the treatments of different concentrations of enrofloxacin. The growth changes of Isochrysis galbana were measured by using the cell counting method and spectrophotometric method， and the composition and content of fatty acid in Isochrysis galbana were measured by using the gas chromatographic method. The results showed that enrofloxacin exhibited a low promoting and high inhibiting effect on the growth of Isochrysis galbana， namely， showing a promoting effect when the concentration of enrofloxacin was ≤0.625  mg·L-1  ， and showing an inhibiting effect when the concentration of enrofloxacin was ≥5 mg·L-1  ， but there was no concentration effect relationship. Under the stress of enrofloxacin， the composition and content of fatty acid in Isochrysis galbana changed. With the increase of incubation time， the total content of fatty acid in Isochrysis galbana decreased， and when the incubation time was 24 h and 96 h， the content of unsaturated fatty acid in each concentration group was lower than that in the control group （the concentration of enrofloxacin was 0

mg·L-1  ）， and the content of DHA was not significantly different from that in the control group. When the concentration of enrofloxacin was ≥5 mg·L-1 and the incubation time was 240 h， the contents of unsaturated fatty acid and DHA in Isochrysis galbana were significantly higher than those in the control group. Therefore， the proportion of unsaturated fatty acids in Isochrysis galbana was increased under the stress of enrofloxacin.

Key words： Isochrysis galbana; Enrofloxacin; Fatty acids; Stress

金藻门的球等鞭金藻Isochrysis galbana是单细胞微藻，无细胞壁，有两条等长的鞭毛，富含色素、蛋白质、脂肪酸等营养物质，具有个体大小适中，易被贝类幼虫捕捉、吞噬、消化吸收，代谢产物对贝类幼虫无毒等饵料藻类所需条件，可作为水产养殖的活体饵料[1] 。球等鞭金藻富含不饱和脂肪酸，能提高水生生物幼体时期的孵化率、存活率和生长率[2] ，是广泛使用的海产养殖动物幼体的理想基础饵料。

恩诺沙星（Enrofloxacin， ENR）是第三代喹诺酮类抗菌药物，是第一个动物专用的抗生素[3] ，也是我国目前水产养殖允许使用的抗生素药物之一[4] 。ENR可以通过抑制酶的切割和连接作用，从而阻碍细菌DNA的复制，达到抗菌的目的，其具有抗菌广谱性、抗菌活性强等特点，在水产养殖中得以广泛应用[5] 。抗生素对藻类具有抑制作用和毒性，同種抗生素对不同藻类的影响不同[6-7] ，有研究表明ENR对斜生栅藻、铜绿微囊藻、小球藻等具有一定的毒性作用，对这3种微藻均存在生长抑制作用，且表现出浓度-效应关系[8-10] 。不同抗生素对金藻的影响亦有报道，张莺脐等[11] 认为氟苯尼考对球等鞭金藻的生长呈“低促高抑”的作用，且引起细胞内总脂肪酸含量显著降低;恩诺沙星和盐酸环丙沙星对球等鞭金藻的毒理危害等级分别为高毒和中毒，恩诺沙星的剂量、抑制效应关系表现良好[12] ;土霉素和氯霉素均减小了湛江等鞭金藻增长期的增幅，加快衰退[13] 。

低浓度的抗生素使环境中易产生耐抗生素菌和抗性基因，存在潜在的生态毒理效应[14] 。因此，为探究球等鞭金藻对ENR胁迫的响应，本研究拟在低于致死浓度的ENR处理下，研究球等鞭金藻的生物量、脂肪酸含量及组成的变化，以初步了解恩诺沙星胁迫对球等鞭金藻的生长和脂肪酸合成积累的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

球等鞭金藻OA3011（GYH15 Isochrysis galbana OA3011）来自福建省微藻种质改良工程技术研究中心保种，经本实验室扩培至一定浓度时得到试验材料。恩诺沙星（ENR）注射液（合肥中龙神力动物药业有限公司，兽药字120151295，规格10 mL∶0.25 g）。试验过程中所用器具均经121℃灭菌锅中高温灭菌。

1.2  藻类培养

选用F/2培养基，按照1∶2接种量接种藻液，海水盐度为（29±1）‰，pH为（8.00±0.10），培养体积为1 L，锥形瓶瓶口使用无菌透气封口膜封口以防污染，培养温度为（25±1）℃，培养光照为4000  lx，光暗比为12L∶12D，每天定期摇藻3次，培养周期10 d。试验设置对照组（ENR浓度为0 mg· L-1  ）、低浓度组（ENR浓度为0.3125、0.625 mg· L-1  ）、中浓度组（ENR浓度为1.25、2.5 mg· L-1  ）、高浓度组（ENR浓度为5、10 mg· L-1  ），每个浓度组各设3个平行。

1.3   生物量测定

1.3.1 细胞密度测定 取1 L原藻液稀释成5个不同浓度梯度，通过酶标仪（INFINITE 200 PRO，TECAN）测定其在波长680 nm处的OD值，并用血球计数板在光学显微镜下进行细胞密度的测定，建立OD-细胞密度标准曲线（y=17.399x-1.672，R 2= 0.998）;通过离心得到5个不同浓度梯度的藻泥后置于真空冷冻干燥机（LGJ12，松源华兴）冷冻干燥至恒重，建立细胞密

度细 胞干重标准曲线（y=0.021x+0.005，R 2=0.997），OD值与细胞密度、细胞密度与细胞干重之间均具有良好的相关性。

培养期间，用酶标仪于波长680 nm处检测对照组和各试验组藻液的OD值，再根据OD值细 胞密度标准曲线得到细胞密度。

1.3.2 对数生长期的比生长速率 球等鞭金藻的比生长速率的计算公式[15] 如下：

μ=lnxt-lnx0t

式中：Xt、X0（×10 6个·mL-1 ）为对数生长期初期和末期的细胞密度;t为对数生长期持续的时间，本试验中t为 4 d。

1.4 脂肪酸提取及测定

1.4.1 脂肪酸的提取 在第0、24、96、168、240 h，收集不同浓度的恩诺沙星处理的藻液100 mL，12000  r·min-1  离心10 min获得藻团细胞，用蒸馏水洗涤3次，放-80℃冰箱备用，将藻团转至冷冻干燥机冷冻干燥48 h[16] 。先对样品进行甲酯化，再用1 mL正己烷对获取的脂肪酸甲酯进行萃取[17] ，充分混匀，用一次性注射器吸取上层溶液过0.22 μm有机滤膜，装于棕色进样瓶，准备气相检测。

1.4.2 脂肪酸成分的测定 气相色谱分析：使用气相色谱仪（7890A GC System，Agilent Technologies，USA）对藻细胞内脂肪酸含量进行检测。色谱柱：SP2560 100M×0.2 um，色谱条件：前检测器温度为250℃，色谱柱加热温度：初始温度为140℃，维持5 min，再以4℃·min-1 的加热温度加热到250℃，再维持12.5 min，进样量为1 uL。标品为SIGMA公司的Fatty Acid Methyl Ester，

C8～ C22，外加DHA，内标为十九酸甲酯。各主要脂肪酸含量计算，采用面积归一化法[18] 。

1.5 数据处理

采用GraphPad Prism 8.0.1软件作图，运用Excel 2013软件进行统计分析，经T检验，当P<0.05时认为具有显著相关性，当P<0.01时认为具有极显著相关性，试验数据以平均值±标准误（Mean±SE）表示。

2 结果与分析

2.1 恩诺沙星对球等鞭金藻生长的影响

2.1.1 恩诺沙星对球等鞭金藻细胞密度的影响 不同浓度ENR对球等鞭金藻生长的影响见图1。当培养时间为24 h时，中浓度处理组藻细胞密度在（2.51～2.78）×10 6 个·mL-1  ，与对照组相比显著增加，低、高浓度处理组与对照组差异不显著;当培养时间为96 h时，低浓度处理组藻细胞密度极显著高于对照组（P<0.01），其藻细胞密度在（6.52～6.81）×10 6个·mL-1  ，中、高浓度处理组与对照组差异不显著;当培养时间为168 h，处理浓度为0.3125  mg· L-1  时，其藻细胞密度为6.72×10 6个·mL-1  极显著高于对照组（P<0.01），高浓度处理组藻细胞密度分别在（4.60～4.74）×10 6个·mL-1  显著低于对照组（P<0.05）;当培养时间为240 h时，处理浓度为0.3125  mg· L-1  时，其藻细胞密度为9.83×10 6个·mL-1  极显著高于对照组（P<0.01），高浓度处理组藻细胞密度在（6.43～6.70）×10 6个·mL-1  显著低于对照组（P<0.05）。因此，低浓度的ENR胁迫促进了球等鞭金藻的生长，而高浓度的ENR会抑制球等鞭金藻的生长。

2.1.2 恩诺沙星对球等鞭金藻比生长速率的影响 不同浓度ENR处理后，球等鞭金藻比生长速率见图2，低浓度处理组球等鞭金藻的比生长速率高于对照组，分别为0.323和0.312;中、高浓度处理组球等鞭金藻的比生长速率在0.246～0.257，低于对照组的0.262 。当ENR处理浓度≥1.25 mg·L-1  时，其比生长速率并未表现出浓度-效应关系。

2.2 恩诺沙星对球等鞭金藻细胞脂肪酸的影响

2.2.1 恩诺沙星对球等鞭金藻脂肪酸总含量的影响  20种常见混合脂肪酸的标准品溶液气相色谱图见图3，球等鞭金藻提取的脂肪酸气相色谱图见图4，不同浓度ENR对球等鞭金藻脂肪酸总含量影响见图5。当培养时间为24 h时，高浓度组球等鞭金藻脂肪酸总含量显著高于对照组（P<0.05），其中处理浓度为 5 mg· L-1  达到最大值（22.80±0.98）%，低、中浓度处理组与对照组相比差异不显著;当培养时间为96 h时，各浓度处理组的脂肪酸含量与对照组相比差异不显著;当培养时间为168 h，处理浓度为 5 mg·L-1  时球等鞭金藻脂肪酸含量为（8.93± 0.27）%，显著低于对照组（10.54±0.70）%（P<0.05）;当培养时间为240 h时，各浓度处理组的脂肪酸含量与对照组相比差异不显著。

2.2.2 恩诺沙星对球等鞭金藻脂肪酸组成成分的影响 不同浓度ENR对球等鞭金藻各脂肪酸组成和含量的影响见图6和表1。当培养时间为24、96 h时，各浓度处理组饱和脂肪酸（SFA）含量均大于对照组，总不饱和脂肪酸含量均小于对照组，其中单不饱和脂肪酸（MUFAs）和多不饱和脂肪酸（PUFAs）含量均低于对照组，高浓度组不饱和脂肪酸含量分别在14.12%～15.89%和22.30%～24.55%，显著低于对照组26.63%和27.50%（P< 0.05）;当培养时间为168 h时，各浓度处理组的脂肪酸含量差异不显著;当培养时间为240 h时，高浓度处理组饱和脂肪酸含量在62.12%～63.48%，低于对照组的68.37%，高浓度处理组不饱和脂肪酸含量在36.52%～37.88%，显著高于对照组的31.63%（P<0.05），其中单不饱和脂肪酸含量在22.27%～23.14%，高于对照组的18.49%，多不饱和脂肪酸与对照组差异不显著，低、中浓度处理组与对照组饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸差异均不显著。因此，随着培养时间的增加，各试验浓度组饱和脂肪酸含量呈下降趋势，不饱和脂肪酸含量呈上升趋势。

表1为培养时间240 h时，不同浓度ENR处理下，球等鞭金藻各脂肪酸占所检测出总脂肪酸的百分比。试验组培养的球等鞭金藻中富含C14∶0 、C16 系列、C18 系列、C20∶1 、C22∶1 、C22∶6 （DHA）等脂肪酸，其中以C16∶0  居多。随着处理浓度的增加，饱和脂肪酸中的C16∶0 、C18∶0 呈下降趋势，不饱和脂肪酸中的C18∶1 、C20∶1 呈上升趋势，各试验浓度组中C18∶1 含量顯著高于对照组，高浓度处理组除C18∶2 外，其他不饱和脂肪酸含量均显著高于对照组;当处理浓度为5 mg· L-1  时DHA含量为（7.37±0.08）%极显著高于对照组（6.67±0.08）%（P<0.01），处理浓度为10 mg·L-1  时DHA含量为（7.38±0.34）%显著高于对照组（6.67±0.08）%（P<0.05）;高浓度处理组饱和脂肪酸含量分别为（63.48±0.37）%、（62.12±1.05）%，极显著低于对照组（68.37±0.42）%（P<0.01），但单不饱和脂肪酸与之相反，高浓度处理组单不饱和脂肪酸含量分别为（22.27±0.35）%、（23.14±1.00）%，极显著高于对照组（18.49±0.38 ）%（P<0.01），多不饱和脂肪酸含量分别为（14.25±0.09）%、（14.74±0.35）%，极显著高于对照组（13.15±0.04）%（P<0.01）;总不饱和脂肪酸在处理浓度为10 mg· L-1  时达到最大值，为（37.88±1.05）%。试验组中ENR胁迫对球等鞭金藻脂肪酸组成及含量具有明显影响。

3 讨论与结论

微藻在受胁迫时，能表现出毒物效应，即在低浓度下某些有毒化合物可以在一定的程度上促进细胞的某些生理活动[19] 。有研究表明，在一定范围内乙酸乙酯粗提物对球等鞭金藻细胞生长有一定的促进作用[20] ;氨苄青霉素、链霉素在较低浓度时可以促进藻体生长，高于一定质量浓度则表现出抑制作用，且不同藻类响应程度及阈值存在较大差异[21] 。本研究中，低浓度处理组球等鞭金藻的细胞密度和比生长速率均大于对照组，但中浓度处理组球等鞭金藻的细胞密度和比生长速率与对照组差异不显著，未表现出浓度依赖特征。四环素、土霉素、恩诺沙星对球等鞭金藻、三角褐指藻的活性氧（ROS）含量均具有促进作用，且随浓度的增加，促进作用越明显[22] 。当受到胁迫时，藻体细胞产生大量的活性氧并急剧积累，膜系统受到损失，能引起体内氧化胁迫，甚至引起细胞代谢紊乱，最终抑制藻体的生长发育[23] 。本研究中高浓度处理组在168 h后对球等鞭金藻的生长表现出明显的抑制作用，与上述研究结果类似。

球等鞭金藻中的不饱和脂肪酸具有较高的营养价值，特别是DHA，在许多水生动物幼体的生长过程中是必不可少的。有研究表明，在虾、海水鱼、软体动物等水生动物幼体时期投喂球等鞭金藻可提高其生长和存活率[24] 。经紫外诱变的突变藻株的不饱和脂肪酸含量高于原始藻株，DHA含量也高于原始藻株[25] ;低温诱导可以提高球等鞭金藻DHA的产量，当球等鞭金藻受到胁迫时，其DHA作为非酶促小分子抗氧化物质，与抗氧化保护酶系统共同作用，清除低温诱导产生的ROS[26] 。ENR胁迫也使球等鞭金藻的DHA含量得到明显提高，与上述结果类似。

微藻在不同的环境中，其各类脂肪酸的比例会发生改变，脂肪酸的组成也会因此产生变化[27] 。在受胁迫环境条件下，生物本身为保持其正常生理功能，通过升高其自身的不饱和度，以增加细胞膜的流动性[28] ，因此脂肪酸去饱和在受胁迫时起到重要作用[29] 。ENR胁迫下，高浓度处理组中球等鞭金藻的不饱和脂肪酸呈现上升趋势，可能原因是高浓度处理组的去饱和酶的活性提高，增强了去饱和作用，使得不饱和脂肪酸的占比得以提高。因此，抗生素胁迫也许可作为筛选高不饱和脂肪酸含量藻株的一种途径。

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（责任编辑：柯文辉）