玉米象的形态和分子特征鉴定

邹茗惠 许薇 薛琪琪 朱志伟 李媛媛 赵金红

摘要 [目的]通過形态和分子特征鉴定玉米象。[方法]从采集到的大米样本中分离出玉米象，分别在高速度数码显微系统和扫描电镜下观察其外部形态和细微形态并进行拍照鉴定。同时提取DNA对cox1和ITS基因进行测序和分析。[结果]玉米象的体躯由头、胸、腹3部分组成，胸部由3个胸节组成，有胸足3对，体表散布密集的刻点。明显的鉴别特征有头部的额和颊延伸成象鼻状的喙，触角呈膝状弯曲，共见8个小节，口器位于细长喙的端部，上唇基本退化，代之为口上片，下颚须和下唇须退化而僵直，外咽片消失。雄虫外生殖器隐藏于腹部，来源于第9腹节，阳茎背面扁平，有2条平行的纵凹沟，雌虫Y形骨片尖。经克隆PCR扩增得到cox1、ITS基因片段大小分别为441、1 445 bp，与已报道的玉米象cox1基因同源性分别为99.7%～100%，ITS基因为99.0%～99.3%。[结论]根据高速度数码显微系统和电镜下玉米象的形态特征，结合cox1和ITS基因序列分析，可为玉米象的鉴定和生物学分类提供依据，也可为防治玉米象对储粮的危害奠定基础。

关键词 玉米象;外部形态;分子特征

中图分类号 S 379.5  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）20-0113-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.029

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Morphology Observation and Molecular Characteristics of the Sitophilus zeamais

ZOU Ming-hui，XU Wei，XUE Qi-qi et al （Department of Medical Parasitology，Wannan Medical College，Wuhu，Anhui 241002）

Abstract [Objective]To identify Sitophilus zeamais according to morphology and molecular characteristics.[Method]Sitophilus zeamais were collected from the rice，then observed under an high speed digital microscope system and scanning electron microscope.PCR and walking sequencing were used to obtain cox1 and ITS sequences of the DNA samples extracted from Sitophilus zeamais.[Result]The body of Sitophilus zeamais was composed of three parts： head，chest and abdomen.The chest was composed of three thoracic ganglia，which had three pairs of feet.The distinguishing features were as follows： the forehead and cheek of the head extend into an elephant nose-like beak，the antennae bend knee-like，a total of 8 sections can be seen，the mouth organ is located at the end of the slender beak，the upper lip was basically degenerated，replaced by the upper lip，the mandibular and lower lip whiskers were degenerated and rigid，and the external pharynx slice disappears.The male genitalia was hidden in the abdomen and originates from the 9th abdominal ganglion.The dorsal surface of the male was flat with two parallel longitudinal grooves.The length of ITS and cox1 from the Sitophilus zeamais were 1 445 bp and 441 bp，respectively.Compared with reported Sitophilus zeamais，the homology of cox1 and ITS gene were 99.7%-100% and 99.0%-99.3%，respectively.[Conclusion]The Sitophilus zeamais was identified according to the morphological characteristics under high speed digital microscope system and scanning electron microscope，and the molecular characteristics based on cox1 and ITS genes.It provides a basis for identification and biological classification of Sitophilus zeamais，and also lays a foundation for controlling the harm of Sitophilus zeamais to grain storage.

Key words Sitophilus zeamais;Morphology observation;Molecular characteristics

基金项目 安徽省自然科学基金面上项目（1608085MC77）;安徽省高校优秀青年人才支持计划重点项目（gxyqZD2016171）。

作者简介

邹茗惠（1996—），女，江苏徐州人，硕士研究生，研究方向：病原生物学。*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事病原生物的生物学与生态学研究。

鸣  谢 该研究得到安徽师范大学生命科学院电镜室闫浩老师大力协助。

收稿日期 2021-01-15;修回日期 2021-02-01

玉米象（Sitophilus zeamais）隶属于节肢动物门（Arthropoda）有颚亚门（Mandibulata）六足总纲（Hexapoda）昆虫纲（Insecta）有翅亚纲（Pterygota）鞘翅目（Coleoptera）象甲科（Curculionidae）谷象属（Sitophilus），是一种世界性广泛分布的储粮害虫[1]。玉米象寄生在禾谷类种子上，如荞麦、花生仁、豆类、谷粉、面包等，以成虫啃食或幼虫蛀食的方式危害储粮，主要危害贮存 2～3 年的陈粮[2]，大量发生时可引起储粮发热、霉变和结块，造成储粮的严重损失，影响储粮的供给。此外，玉米象的排泄物、遗留的尸体，不仅会产生难闻的气味，还会产生对人体有害的物质。作为一种重要的储粮害虫，玉米象的种群危害程度和防治一直是学者关注的重点，目前针对玉米象的研究大多集中在其生态学和防治技术上。形态鉴别是鉴定玉米象直观的方法，也是各项生物学研究的基础，目前对于玉米象细微结构的研究鲜见报道。分子鉴定是相较于形态鉴定更为准确和简单的方法，其中细胞色素氧化酶亚基 I（cytochrome oxidase I，cox1）和内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）是鉴定物种较好的分子标记。笔者在高速度数码显微系统和扫描电镜下观察玉米象的外部形态和细微形态特征，然后对玉米象的cox1和ITS基因进行扩增和序列分析，为玉米象的形态学鉴定和生物学分类提供更为丰富的依据，同时为进一步开展玉米象的种群遗传学研究、物种间系统进化及生物防治技术研究等提供资料。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 高速度数码显微系统（中国 KEYENCE，vw600C型），扫描电子显微镜（日本JEOL，JSM-6490LA型），乙醚，无水乙醇，戊二醛，氢氧化钠，Taq PCR Master Mix，Proteinase K，DNA Polymerase和DNA marker DL 2000购于上海生物工程有限公司。

1.2 样本采集 玉米象样本采集于储存时间≥1年的大米中。

1.3 方法

1.3.1 高速度数码显微系统标本制作。用零号毛笔从大米样本中挑出玉米象，用蒸馏水温和洗涤，置于5%氢氧化钠溶液中消化数小时，然后用蒸馏水漂洗，依次用不同浓度的乙醇溶液进行逐级梯度脱水，整姿置于载玻片上利用高速度数码显微系统进行观察并拍照。

1.3.2 电镜样本制备。将玉米象置于蒸馏水中洗净，置2.5%戊二醛固定后，依次用不同浓度的乙醇溶液进行逐级梯度脱水，再用5%醋酸戊酯置换后，将其固定在覆盖导电双面胶的电镜样品托上，临界点干燥后在电镜下（5～10 kV加速电压）进行扫描，拍照并观察。

1.3.3 DNA提取、引物设计和PCR克隆扩增。用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）提取单头玉米象的基因组DNA。DNA提取结束后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA质量，并用超微量核酸检测仪检测基因组DNA 浓度，将检测合格的基因组 DNA 于-20 ℃保存备用。

cox1序列扩增引物序列如下[3]：

COIF： 5′-TCTATTCTTGGAGCTATT-3′

COIR： 5′-TAGGGACTGCAATAATTAT-3′

ITS擴增引物序列如下[4]：

ITSF：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′

ITSR：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′

引物由通用生物技术有限公司合成。所用PCR引物见表1。

PCR反应总体积为25 μL，含2.5 μL 10×Buffer、2.0  μL MgCl （2.5 mol/L）、1.5 μL dNTPs （2.5 mmol/L aech）、上下游引物（5 μmol/L）各1.0 μL、100 ng模板基因组DNA和1 U Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加无菌水补足。PCR反应参数：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34个循环;72 ℃终延伸10 min。

PCR产物用1%琼脂糖电泳和DNA 胶回收试剂盒纯化后，连接到载体pMD19-T上，转化至大肠杆菌（DH5α 感受态细胞）中，通过蓝白斑筛选，将阳性克隆委托通用生物技术有限公司采用DNA 测序仪（ABI-3730）进行双向测序。

1.3.4 测序与序列分析。目的条带测序工作由通用生物技术有限公司完成。测定序列经过DNAMAN（6.0.3.99）软件拼接，所得序列用DNAStar（V7.10）软件中的EditSeq编辑，分析其碱基组成，同时利用DNAStar和DNAMAN软件进行同源性分析并构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 形态学特征

2.1.1 玉米象在高速度数码显微系统下的形态特征。玉米象成虫体长3.5～5.0 mm，圆筒形，红褐色，有光泽性。前胸背板前狭后宽，上面布满圆形刻点。后端约等于鞘翅之宽，背面刻点圆形（图1A）。腹面可见体躯由头、胸、腹3部分组成，胸部由3个胸节组成，有胸足3对（图1B）。头部额区向前伸形成啄，头部两侧有复眼1对，复眼由多数小眼组成（图1C）。复眼之间有1对触角，触角呈膝状弯曲，由8小节组成（图1D）。腹部由多个小节组成。雄虫外生殖器隐藏于腹部，阳茎背面扁平，有2条平行的纵凹沟，雌虫的Y形骨片端部较尖（图1E、F）。玉米象背面胸腹部被鞘翅所遮挡，鞘翅的基部和端部可见明显的2对黄色椭圆形斑纹（图1G）。3对足形态基本相同，足上着生大量刺，最末端着生1对爪，2爪在基部愈合（图1H）。

2.1.2 玉米象在扫描电镜下的形态特征。

背面观察玉米象时仅可见头部和前胸背板，中胸、后胸和腹部常常被鞘翅所遮盖，体表散布密集的刻点（图2A）。

玉米象的体躯由头、胸、腹3个部分组成，胸部由3个胸节组成，有胸足3对，其中前胸最为发达（图2B、C）。

头部的额和颊延伸成象鼻状的喙，口器着生于喙端，头部两侧有复眼1对，呈圆形突出，复眼由多数小眼组成，复眼和额之间有唇基，唇基和额之间由1条弯曲的缝分隔。复眼之间可见触角1对（图2D）。触角呈现膝状弯曲，包括柄节、梗节和鞭节3部分，共可见8个小节。其中，柄节有1节，呈现棒槌状，粗长，与头部接触处有凹陷。梗节1节，鞭节可见由6个亚鞭节组成，第1～5个亚鞭节呈现为套筒状，每节都像1个梯形，从第2节开始逐节变粗，第6个鞭节膨大，整体呈现长椭圆形，形状类似于毛笔头，截面近似于圆形，端部密集生长着多个感受器（图2E）。玉米象的口器位于细长喙的端部，上唇基本退化，代之为口上片，上颚可见4个切齿，下颚须和下唇须退化而僵直，不能弯曲，外咽缝合二为一，外咽片消失（图2F）。胸由前胸、中胸和后胸组成，前胸板呈横形（宽大于长），前胸的后部在前足基节向后突出，嵌入中胸前方的凹陷处，两侧有沟槽，用以收纳触角（图2B）。中胸前部窄，部分深入到前胸内，后部宽，腹面短，窄于后胸（图2G、H）。腹部与后胸牢固相连，由10节组成。雄虫外生殖器隐藏于腹部，来源于第9腹节，阳茎背面扁平，有2条平行的纵凹沟，是玉米象和其相近米象的主要鉴别特征（图2I）。每一胸节腹面有足1对，称为前足、中足和后足。3对足中，前足最小，后足最发达。足从基部到端部由6部分组成，分别为基节、转节、腿节、胫节、跗节和爪。前足的基节可以活动，呈横卧的圆球形（图2J）。中足和后足的基节不明显，活动受限（图2K、L）。除基节外，3对足形态基本相同，转节很小，与基节相连，腿节和转节相連，并与转节一起活动。腿节十分粗壮，伴有刺和齿突。胫节和腿节相连，着生大量的刺，跗节和胫节相连，由3个亚节组成，最末跗节的端部着生爪1对，2爪在基部愈合（图2J、K、L）。

2.2 分子生物学特征 将提取到的玉米象DNA进行PCR扩增，得到清晰的cox1和ITS基因片段扩增产物（图3），克隆扩增去掉引物后，所得cox1和ITS基因片段大小分别为441 bp（MW357434）和1 222 bp（MW356870）。

2.3 同源性和系统发生关系分析 在GenBank中通过Blast比对，下载19种同源性较高的象甲科象虫cox1基因序列（表2），将该研究获得的玉米象cox1基因片段与GenBank中已报道到的其他象甲科已知象虫的线粒体DNA cox1 序列片段进行同源性分析，发现其与Corrêa等[5]测得的3个玉米象参考序列同源性为100%以外，与其他玉米象cox1基因序列的同源性为97.9%～99.8%。玉米象与其他几种象虫的同源性为78.2%～88.2%，其中与同属于谷象属的米象（Sitophilus oryzae）和谷象（Sitophilus gra-narius同源性最高，均为87.5 %，与北方材小蠹（Anisandrus dispar）为75.1%。同时将该研究获得的玉米象cox1基因序列与近属的几种象甲科象虫cox1序列以昆虫纲的隆额网翅蝗 （Arcyptera coreana NC 013805.1）为外群，利用DNAMAN分析软件构建NJ系统发育树（图4），可见所有的玉米象（Sitophilus zeamais）聚集在同一支，同时又与米象（Sitophilus oryzae）和谷象（Sitophilus granarius）形成一个属的分支。同样，沟框（Eucryptorrhynchus chinensis）和臭椿沟眶象（Eucryptorrhynchus brandti）聚集在同一支，肾点毛小蠹 （Dryocoetes autographus）和北方材小蠹（Anisandrus dispar）聚集在同一支，17种象虫最终聚集在一起，与隆额网翅蝗 （Arcyptera coreana）分开，符合形态学同一属的分类。在GenBank中通过Blast对，下载8种同源性较高的象甲虫ITS基因序列（表3）。同样，将该研究获得的玉米象ITS基因片段与GenBank中已报道到的其他象甲科已知象虫的ITS序列片段进行同源性分析，发现其与Corrêa等[6]所测得的5个玉米象参考序列同源性分别为99.0%和99.3%、99.3%、99.1%、99.1%，和米象（Sitophilus oryzae）ITS序列的同源性为93.3%，与谷象（Sitophilus granarius）ITS序列的同源性为83.1%。同时将该研究中获得的玉米象ITS基因序列与另外下载的8个象甲科象虫ITS序列以松纵坑切梢小蠹虫（Tomicus piniperda AH 011346.2）为外群，利用DNAMAN分析软件构建NJ系统发育树（图5），可见6个玉米象（Sitophilus zeamais）的ITS序列聚集在同一支，2个米象（Sitophilus oryzae）的ITS序列聚集在同一支，同时它们和谷象（Sitophilus granarius）形成一个属的分支，并与松纵坑切梢小蠹虫（Tomicus piniperda）分开。

3 讨论

玉米象是储粮的头号大害虫，对多种谷物和其加工物均能造成严重危害，在我国各省区和大多数国家和地区皆有广泛分布。玉米象成虫喜阴暗，趋温、趋湿，具有假死性。耐寒力、耐饥力和产卵力都较强，发育速度快。成虫食害禾谷类种子，以及面粉、油料、药材等仓储物，其中小麦、玉米、糙米及高粱受害最重;幼虫则只在禾谷类种子内为害。

目前对玉米象整体的形态和细微形态特征的研究尚不够全面。张生芳[10]直接在光镜下观察玉米象形态，并对玉米象的整体形态进行了简单概括，提出玉米象和米象形态十分相似，仅仅可以根据外生殖器的形态差别来鉴别2种象虫。陈帆[11]利用扫描电子显微镜对玉米象成虫口器的细微形态进行了分析并与其他几种甲虫进行比较。数码显微系统对玉米象进行整体观察简单直接，可以清楚了解玉米象的外部形态整体特征，但标本的细微结构不易被观察，借助扫描电镜则可以清晰地观察玉米象的细微结构特征。该研究结合扫描电镜和高速度数码显微系统的观察，系统描述了玉米象的形态特征，结果发现，在高速度数码显微系统的观察下，玉米象的形态与其他研究基本相同，而在扫描电镜下可清晰地观察到形态的主要鉴别特征：①头部：头部两侧有复眼1对，呈圆形突出，复眼和额之间有唇基，唇基和额之间有1条弯曲的缝分隔。②触角：触角呈现膝状弯曲，包括柄节、梗节和鞭节3部分，共可8个小节。其中，柄节有1节，梗节1节，鞭节可见由6个亚鞭节组成。③口器：口器位于细长喙的端部，上唇基本退化，代之为口上片，上颚可见4个切齿，下颚须和下唇须退化而僵直，不能弯曲，外咽缝合二为一，外咽片消失。④外生殖器：雄虫外生殖器隐藏于腹部，来源于第9腹节，阳茎背面扁平，有2条平行的纵凹沟。雌虫的Y形骨片端部较尖。该研究通过高速度数码显微系统和扫描电镜结合观察玉米象这些形态特征，丰富了玉米象的形态鉴定、分类等科学资料，为玉米象的控制和防治提供了有益的参考。

如其他学者的研究表明，玉米象和其同属的米象在形态上难以鉴别，仅仅可以依靠外生殖器的形态差别进行鉴别，而分子鉴定则可以补充玉米象的形态学鉴定。分子鉴定最常用的2个分子标记为cox1和ITS，它们在动物分子鉴定以及系统重建过程中具有重要意义。杨瑞生等[12]克隆了3个橡实象虫cox1基因约556 bp的片段，并与其他24种昆虫的同源片段进行分析，研究表明利用cox1基因序列可以明显地鉴定出橡实象虫。王桂花[13]通过微卫星（SSR）和线粒体cox1基因分析了福建省12个红棕象甲地理种群的遗传差异，更深入地了解红棕象甲的入侵及扩散范围，为红棕象甲的入侵途径和不同地理种群的防控提供理论基础。该研究成功获得玉米象的cox1序列片段，同时对已知10余种象甲科象虫的cox1序列进行同源性分析，发现所测得的玉米象cox1序列和大部分已知的玉米象参考序列同源性为100%，与在巴西和墨西哥测得的玉米象参考序列具有略微差异，可能是由于地理差距导致。玉米象与其他象虫的同源性为75.1%～87.5%，将几种象虫的cox1序列构建系统发育树，发现象甲科这几种象虫具有一定的亲缘关系，同时明确可见玉米象和米象、谷象亲缘关系最近，同形态学的鉴定分类结果一致。ITS是对昆虫进行发育研究常应用的核基因。真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18S rDNA和5.8S rDNA 4 种，它们在染色体上头尾相连、串联排列，相互之间由间隔区分隔。其中18S、5.8S和28SrDNA基因组成一个转录单元，三者高度保守，适合较高等级水平生物群体间的系统分析。该研究成功获得玉米象的ITS基因序列。同样，同源性分析发现所测得的玉米象与已知玉米象的ITS序列有略微差异，可能是来自安徽和中国台湾、巴西的地理差异，Corrêa等[5]测得的4个巴西的玉米象ITS序列彼此之间也有略有差异，可能来自个体的差异。同时发现玉米象和谷象、米象ITS序列的同源为83.1%和93.3%，表明ITS可以作为种间鉴定的依据。将几种象虫的ITS序列构建系统发育树，明确可见玉米象和米象、谷象可以聚集在同一属，同形态学的鉴定分类结果一致。该研究测定了玉米象核基因ITS、线粒体基因cox1基因序列，可作为探讨玉米象及其与其他象虫种间系统进化关系的分子标记，同时可以为玉米象的防治研究提供分子基础。

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