基于偏最小二乘回归法的黑果菝葜乙酸乙酯部位抗肿瘤谱效关系

王春艳， 侯益民， 李汉伟， 苏秀红,2*， 董诚明,2， 陈随清,2

(1.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046；2.呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南 郑州 450046)

近年来，肿瘤的发病率不断攀升，恶性肿瘤严重影响人类的身体健康甚至危及生命，而治疗肿瘤的基本手段主要依赖于放疗和化疗，但放化疗药的不良反应较大，故从天然植物中寻找和开发高效低毒的抗肿瘤药物，具有广阔的研究前景[1]。

黑果菝葜为百合科菝葜属攀援灌木，收载于《中华本草》《南阳中草药名典》《秦岭植物志》《涉县中药志》等著作。以根茎入药，为“金刚藤”基源之一，具有祛风、清热、利湿、解毒等功效，临床上常用于治疗风湿关节痛、跌打损伤、盆腔炎等疾病[2]。研究表明菝葜属植物中多含有黄酮类物质，有抗肿瘤的活性，且菝葜属植物中菝葜、土茯苓等对肿瘤细胞具有明显的抑制作用[3]。有研究表明，临床复方菝葜颗粒可较好地治疗非小细胞肺癌[4]。张莲萍[5]认为菝葜乙酸乙酯提取物的抗癌活性高于正丁醇及乙醇提取物；王涛等[6]发现菝葜的乙酸乙酯提取物质可有效抑制肝癌细胞的增殖；吴先闯等[7]比较了菝葜乙醇总提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位对3种肝癌细胞的抑制活性，其乙酸乙酯部位对肝癌细胞抑制活性最强。故课题组选用黑果菝葜乙酸乙酯部位进行抗肿瘤筛选，且黑果菝葜作为菝葜属中一个常用的药用植物资源可能具有潜在的抗肿瘤研发价值，但目前对黑果菝葜的研究甚少[8-9]。

中药是多成分、多靶点综合作用的复杂体系，其药效是多种成分共同作用的结果，而中药谱效学是基于解决中药活性成分复杂、药理作用机制不明等问题的一门学科，广泛应用于中药药理活性的物质基础研究，可将化学成分的变化与药效指标相结合，为中药的质量控制和药效评价提供科学依据[10]。目前虽然有研究对黑果菝葜中的成分进行了分离鉴定，但尚未见关于该药用植物中各成分与其抗肿瘤活性的研究。因此，本研究通过体外实验考察了黑果菝葜乙酸乙酯部位对肝癌SMMC-7721细胞、人非小细胞肺癌A549细胞、人胃癌MGC80-3细胞抑制率影响，以确定其抗肿瘤活性部位并建立黑果菝葜抗肝癌SMMC-7721细胞活性部位的指纹图谱，在此基础之上探究黑果菝葜活性部位指纹图谱特征峰与药效间的相关性，以期揭示黑果菝葜抗肿瘤活性的药效物质基础，为黑果菝葜中抗肿瘤活性成分的提取富集及其资源合理开发和临床应用提供参考。

1 材料

Waters e2695-2489型高效液相(美国沃特世公司)；VARIOSKAN LUX型自动酶标仪、Scilentific 371型CO2恒温培养箱(美国赛默飞世尔公司)；IMS105DU型天平(万分之一，瑞士梅特勒-托利多集团)；EYELAN-1100旋转蒸发仪、EYELA FDU-1200型冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)。

胎牛血清(武汉普诺赛生命科技有限公司，批号SA190501)，MEM培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司，批号WH0111201911SP)；噻唑蓝(MTT，批号725C0511)、DMSO(批号11001G031)、0.25%胰酶(批号2050302)、青霉素-链霉素混合液(双抗)(批号20190712)，以上试剂均购自北京索莱宝科技有限公司。

人肝癌SMMC-7721细胞、人非小细胞肺癌A549细胞、人胃癌MGC80-3细胞购自中国科学院上海细胞所。黑果菝葜采集信息见表1，由河南中医药大学苏秀红教授鉴定为百合科菝葜属黑果菝葜Smilaxglauco-chinaWarb.。

表1 样品信息

2 方法

2.1 色谱条件 以ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0～15 min，5%～10% A；15～35 min，10%～15% A；35～55 min，15%～20% A；55～90 min，20%～30% A；90～105 min，30%～33% A)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长330 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 称取白藜芦醇对照品适量，加甲醇溶解，制备成适当质量浓度的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 称取黑果菝葜各产地药材粉末100 g，加入10倍量70%乙醇回流提取1.5 h，重复3次，合并滤液，减压回收乙醇，得到乙醇总提物浸膏，蒸干后加水200 mL，取1/5作乙醇总提取液，剩余4/5提取液乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位；减压回收各部位萃取液，冷冻干燥成粉末，配制备成5 mg/mL溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 体外抗肿瘤活性实验MTT法 参考文献[11-13]，人肝癌SMMC-7721细胞用含10%胎牛血清的MEM培养基，人非小细胞肺癌A549细胞和人胃癌MGC80-3细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于5% CO2、37 ℃的培养箱中培养。

取对数生长期的SMMC-7721、A549和MGC80-3细胞株，用0.25%胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的培养液调制成5×104/mL的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种100 μL，置于CO2培养箱中培养24 h后，吸出原培养液，设置对照组(加入等体积不含血清的培养基)和药物组。药物组，乙酸乙酯部位，每组药物设置5个质量浓度梯度(12.5、25、50、75、100 μg/mL)，每个质量浓度复种3个孔，每孔100 μL，置于培养箱中培养48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，继续孵育4 h后，吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，在振荡器上摇匀15 min，待其结晶完全溶解后，设置波长为490 nm，在酶标仪测定OD值。以上实验均重复3次，细胞抑制率=[(OD对照组-OD给药组)/OD对照组]×100%。

2.4 数据处理 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，以Graphpad Prism 7.0软件计算各组样品IC50值。以黑果菝葜指纹图谱中各共有峰的峰面积为自变量，SMMC-7721肿瘤细胞抑制率为因变量，采用SIMCA-P 13.0软件对其进行偏最小二乘回归分析，建立回归方程。

3 结果与分析

3.1 黑果菝葜乙酸乙酯部位对SMMC-7721、A549、MGC80-3细胞抑制率的影响 由表2可知，乙酸乙酯部位给药组在一定质量浓度下对SMMC-7721、A549、MGC80-3细胞均具有抑制作用，当给药质量浓度为100 μg/mL时，IC50值分别为19.27 μg/mL、大于100和无法计算。因此，当给药浓度为100 μg/mL时，乙酸乙酯部位对细胞SMMC-7721细胞抑制作用最强，故选择SMMC-7721细胞株进行以下实验。

表2 黑果菝葜乙酸乙酯部位对SMMC-7721、A549、MGC80-3细胞株的细胞抑制率影响

3.2 黑果菝葜乙酸乙酯部位HPLC指纹图谱建立 按“2.2.2”项下方法制备10批样品的供试品溶液，各吸取10 μL，进行HPLC检测，文件导入“中药指纹图谱相似度评价系统软件(2012.130723)”，设置H3图谱为参照图谱，采用多点校正将色谱峰自动匹配，得出10批样品指纹图谱，见图1，确定了17个共有峰，见图2，以7号峰白藜芦醇为指标峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，见表3。发现各共有峰相对保留时间较为一致，RSD均小于2.33%，相对峰面积RSD为67.715%～218.165%，表明不同产地黑果菝葜主要成分的含量具有一定差异性。通过对比各样品相似度发现，5批样品相似度在0.9以上，见表4，4批在0.8以上，驻马店市西平县出山镇月林村(H5)相似度为0.688。

图1 10批黑果菝葜乙酸乙酯部位样品HPLC指纹图谱

图2 黑果菝葜乙酸乙酯部位样品共有峰

表3 10批黑果菝葜乙酸乙酯部位样品共有峰相对峰面积

表4 10批不同产地黑果菝葜乙酸乙酯部位相似度

3.3 不同产地黑果菝葜乙酸乙酯部位对SMMC-7721细胞抑制率的影响 由表5可知，与对照组比较，10批黑果菝葜样品均有抑制肿瘤的作用(P<0.01)。10批样品进行组间比较，南阳市西峡县双龙镇十亩地村(H1)与南阳市西峡县白羽街道土门社区寿山(H2)无显著性差异(P>0.05)，驻马店市西平县出山镇月林村(H5)、南阳市淅川县上集镇朝阳社区范蠡公园(H7)和南阳市西峡县米坪镇大庄村(H10)无显著性差异(P>0.05)。南阳市方城县二郎庙镇五神庙村(H3)对SMMC-7721细胞抑制效果最好，细胞抑制率为81.115%。

表5 不同产地黑果菝葜乙酸乙酯部位对SMMC-7721细胞抑制率的影响

3.4 黑果菝葜乙酸乙酯部位抗肝癌SMMC-7721谱效关系分析

3.4.1 偏最小二乘回归方程的建立 以不同产地黑果菝葜乙酸乙酯部位指纹图谱各共有峰的峰面积为自变量X，细胞抑制率为因变量Y，导入SIMCA-P 13.0软件，进行偏最小二乘回归分析，得回归方程为Y=0.001 4X1+0.001 6X2-0.005 0X3+0.003 7X4+0.002 4X5+0.002 1X6-0.000 3X7+0.000 5X8-0.000 2X9+0.001 1X10+0.000 8X11+0.002 5X12+0.001 5X13-0.000 7X14+0.003 2X15+0.003 0X16+0.000 9X17，偏最小二乘回归模型回归系数见图3，峰1、2、4、5、6、8、10、11、12、13、15、16、17回归系数为正值，其贡献大小顺序为(绝对值)4>15>16>12>5>6>2>13>1>10>17>11>8，其余峰的回归系数为负值。

图3 黑果菝葜抗肿瘤谱效关系偏最小二乘回归系数

3.4.2 变量重要性分析 变量投影重要性(VIP值)分析结果见图4，表明S1、S3、S5,S6、S7的VIP值大于1，排序为S7>S1>S6>S3>S5，其中，S1、S5、S6与药效成正相关，当含量增加时，会明显提高细胞抑制率；模型诊断参数R2X=0.934，R2Y=0.987，Q2=0.817，表明该回归模型具有较强的拟合解释能力和模型预测能力。

图4 各共有峰对黑果菝葜抗肿瘤活性的变量重要性分析

4 讨论

本研究前期对色谱柱、流动相的比例、柱温以及检测波长等色谱条件进行了探索。比较不同厂家的C18色谱柱的分离效果，发现ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)能有效的分离化学成分，且峰形较好。当采用乙腈-水体系时，得到的色谱峰数量较多且分离度较好。在其他色谱条件相同的情况下，分别设定柱温25、30、35、40 ℃，发现随着温度升高，各色谱峰的保留时间不断前移，当柱温为30 ℃时，色谱峰分离效果好。液相色谱检测波长主要参照白藜芦醇的范围，并参考文献知其为多酚类化合物，波长330～350 nm[14]，由此并对样品进行190～400 nm全波长扫描，考察了在238、290、303、330 nm波长处的色谱峰，图谱在330 nm处出峰较多，且峰形较好。

文一惠等[15]发现金刚藤可抑制SMMC-7721 细胞增殖、诱导细胞凋亡等，但是由于俗名为“金刚藤”的原植物达14种之多，甚至为不同的科属，且未明确指出所研究的金刚藤的基源。但从报道推测应为百合科菝葜属植物，这一结果表明菝葜属植物在抗肝癌方面可能有着一定疗效。本研究发现南阳市方城县二郎庙镇五神庙村(H3)样品对SMMC-7721细胞抑制效果最好。“诸药所生，皆有境界”中医药传统理论历来注重“环境因子”对药材品质的影响，气候和环境的多样性和复杂性，为药用植物的多样性奠定了生态环境的基础。因此可推测，造成这一现象的主要原因有可能是其生长的“微环境”导致了不同产地黑果菝葜化学成分组成与含量的差异是造成其抗肝癌作用强弱的主要原因。

由于有关黑果菝葜化学成分的研究报道较少，本实验前期也采用LC-MS技术对落新妇苷、木犀草苷、黄杞苷、槲皮素、槲皮苷和柚皮素等菝葜属报道的常用成分进行了比对指认，但仅明确了白藜芦醇这一成分为黑果菝葜抗肝癌SMMC-7721的物质基础，因此以此成分作为黑果菝葜的测定指标，对于评价该药用植物的品质具有一定参考意义。本研究建立了黑果菝葜乙酸乙酯部位体外抗肿瘤活性谱效学模型，得出3个特征峰与抑制肝癌SMMC-7721作用关联性较大，未来针对这些特征峰进行系统研究与成分解析，以期有助于深入挖掘黑果菝葜抗肝癌SMMC-7721作用的物质基础，为同类药材的抗肿瘤物质基础研究提供参考，为黑果菝葜临床用药提供依据。