蛋白质组学探索乳腺癌相关差异表达蛋白的研究进展

孙雨露，管忆楠，姚永忠

(1.南京大学医学院附属鼓楼医院 普外科，江苏 南京 210008; 2.东南大学 医学院，江苏 南京 210009)

世界卫生组织国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)2020年最新统计显示，女性乳腺癌现已超过肺癌，成为全球第一大癌种[1]。许多基因组或转录组研究已经揭示了乳腺癌转移以及预后不良的遗传特征[2- 4]。但是人类乳腺癌组织中蛋白质组和转录组数据并不完全一致，这体现了对疾病调控基因进行蛋白水平测量的价值，毕竟蛋白质才是细胞中真正的效应分子[5]。近年来，通过基于质谱(mass spectrometry，MS)法的高通量和高精度蛋白质组学技术，可以揭示乳腺癌发生发展的机制，筛选乳腺癌相关的肿瘤标志物和分子靶点，蛋白质组学已逐渐成为乳腺癌早期诊断、治疗及预后评估的有效方法。作者对近年来蛋白质组学在乳腺癌研究中取得的进展作一综述。

1 蛋白质组学

组学(基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和脂质组学)方法论可以帮助我们更全面更细致地认识复杂的生物系统，被广泛应用于生物医学领域。蛋白质组学是在基因组学和转录组学的基础上迅速发展的新兴学科，它旨在研究蛋白质在任何阶段的表达、结构、功能、相互作用和修饰，可以通过结合生物信息学工具来阐述涉及复杂疾病的生化过程和发展规律，对疾病的早期诊断、治疗、预后判断有指导作用[6- 7]。

最初，酶联免疫吸附测定(enzyme- linked immunosorbent assay, ELISA)和蛋白质印迹只能被用于特定蛋白质的分析，而十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE)、二维凝胶电泳(two- dimensional gel electrophoresis, 2- DE)及二维差分凝胶电泳(two- dimensional differential gel electrophoresis, 2D- DIGE)技术可被用于复杂蛋白质样品检测[8]。近年来，由于MS技术的出现，蛋白质组学研究取得快速进展，高通量高灵敏度的表面增强激光解析电离- 时间飞行质谱(surface- enhanced laser desorption/ionization time- of- flight, SELDI- TOF- MS)和基质辅助的激光解析电离- 时间飞行质谱(matrix- assisted laser desorption/ ionization time- of- flight, MALDI- TOF- MS)使用最为广泛，使蛋白质大分子快速分析鉴定成为可能[9]。而后定量技术例如同位素亲和标签技术(isotope- coded affinity tag，ICAT)、细胞培养稳定同位素标记技术(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)以及同位素标记相对和绝对定量/串联质量标记技术(isobaric tags for relative and absolute quantification/tandem mass tags，iTRAQ/TMT)相继出现，可以将混合体系中所有蛋白质进行精确的鉴定和定量，更加简单、准确、快速[8]。

目前蛋白质组学已用于各类肿瘤，包括肺癌、结直肠癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌等复杂蛋白生物标志物的发现研究。在乳腺癌中，通过对临床上多种样品如组织标本、血清、乳汁溢液、唾液和尿液等进行微量检测，从而筛选得到能够用于早期诊断、治疗监测以及预后判断的乳腺癌潜在生物标志物。

2 蛋白质组学筛选组织中的差异表达蛋白

目前，临床上仍主要依靠雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)的免疫染色结果作为乳腺癌分类的基础，用以指导治疗[10]。2016年Tyanova等[11]分析了40个不同亚型的乳腺癌队列，使用SILAC技术对10 000多种蛋白质进行定量，这些数据提供了对不同亚型进行辨别的分子细节，以及可转化为临床用途的预测特征，作者认为将蛋白质组学技术整合到转化癌症研究中，有助于开发新型乳腺癌标志物并确定潜在的治疗靶标。临床蛋白质组学肿瘤分析协会通过基于MS的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析了一组包含77个组织样本的队列，使用iTRAQ定量鉴定出了12 553个蛋白质和33 239个磷酸化位点，综合分析可以深入了解体细胞突变的功能后果，除了HER2，还鉴定了其他与扩增子相关的高度磷酸化激酶，包括CDK12、PAK1、PTK2、RIPK2和TLK2，或许可以确定治疗靶标[12]。在此基础上，Yanovich等[13]整合了发表的和未发表的共3个数据集生成了一个完整的乳腺癌及健康样本数据集，利用基于MS的蛋白质组学分析对130多个临床乳腺样品进行了研究，证明了不同乳腺癌亚型之间的肿瘤异质性，并且鉴定出两个Luminal A亚型，其中之一具有与三阴性乳腺癌相关信号蛋白活性增加的特征，从而提示Luminal A肿瘤的新型亚型。研究表明基于蛋白质表达对管腔性乳腺癌进行分类可能为更全面的临床评估奠定基础，从而有利于临床医生给出最适合的治疗方案[11，13- 14]。最近，Krug等[15]对122个原发性乳腺癌样本进行蛋白质组学研究，提供了HER2扩增子的详细分析，筛选了可以从免疫检查点治疗中受益的肿瘤亚群，并且可以更准确地评估Rb的状态，以预测CDK4/6抑制剂的反应性。此外，磷酸化和乙酰化蛋白质组学分析为全面了解乳腺癌的生物学特征提供了更多的信息。

3 蛋白质组学筛选血清中的差异表达蛋白

临床上经常应用不同的血清蛋白指标如CA125、CA199、AFP等来监测肿瘤的发生发展，但是在乳腺癌中还没有找到特异的灵敏的血清标志物并将其应用于临床诊疗过程中。近来血清蛋白质组学发展迅速，为乳腺癌的早期诊断提供了新的思路和技术路线。蛋白组学的测定发现了不同亚型乳腺癌中的血清差异表达蛋白，这表明血清也可以帮助鉴别乳腺癌的亚型，有助于早期诊断和更好地治疗该疾病[16]。Yigitbasi等[17]使用SELDI- TOF- MS技术同时分析了乳腺癌、良性肿瘤患者和健康人的血清，预测了4个蛋白峰作为生物标志物，结合CA15- 3指标后可以协助诊断乳腺癌，该模型具有良好的敏感性和特异性。Fredolini等[18]将亲和水凝胶纳米颗粒与LC- MS/MS分析结合使用，鉴定了浸润性导管癌病人血清中的56个候选蛋白质生物标志物，将这些蛋白质与其他癌症病人血清中增加的蛋白进行比较，筛选出32种蛋白质，构建的诊断模型或许可以联合乳腺钼靶来检测早期乳腺癌。也有研究通过不同的蛋白质组学方法分析了复发性和非复发性乳腺癌患者的血清样品，发现在复发性乳腺癌中表观遗传蛋白包括组蛋白去乙酰化酶(HDAC)5、HDAC7、HDAC9、小类泛素化修饰蛋白1(SUMO- 1)、胚胎干细胞表达Ras(RASE)以及促炎蛋白血清淀粉样蛋白A(SAA)、白介素18(IL- 18)的水平上调[19]，这些蛋白或许可以成为疾病复发的生物标志物。另外，迄今为止，男性乳腺癌发病率低，相关研究也较少，Zografos等[20]对11例男性乳腺癌和8例健康人的血清进行MALDI- TOF- MS分析，描述了男性乳腺癌患者的血清蛋白谱，对乳腺癌血清蛋白谱进行了补充。

血清蛋白质组学在乳腺癌治疗以及治疗效果预测、预后判断等方面应用前景广阔。Walaszczyk等[21]在放化疗治疗前和治疗结束后1年(未发现治疗失败的临床症状)时收集病人血清样本进行LC- MS/MS和2D- PAGE分析，其蛋白相对量在治疗前和治疗后样品之间有显著差异，然而长期随访后发现在治疗失败组中这种变化更为明显。该研究表明治疗前后观察到的血清蛋白质组的特定模式变化可用于监测治疗反应，也可用于评估长期预后。Yang等[22]对曲妥珠单抗治疗耐药和有反应的HER2阳性乳腺癌患者治疗前的血清蛋白质进行了TMT标记的多重定量蛋白质组学研究，发现了18种差异表达的蛋白质，并最终证实3种蛋白质(SRGN、LDHA和CST3)与曲妥珠单抗治疗耐药相关，该发现可以提高基于曲妥珠单抗治疗的临床实用性。抗癌药物的副作用是导致乳腺癌治疗效果不满意的原因之一。有研究[23]应用基于MS法的蛋白质组学技术评估了血清外泌体中蛋白质含量与紫杉烷类诱导的周围神经病变严重程度之间的关联，统计显示12种蛋白质的特征导致有周围神经病变和没有周围神经病变的两组病人基线血清样品之间的明显分离，表明基线样品可以预测随后的神经毒性。所以，通过恰当应用蛋白质组学，从患者中获取血清以连续监测不同药物的治疗效果，了解导致毒性增加的因素，将提供进行更多的个性化治疗，以优化治疗效果并改善乳腺癌患者的长期生活质量。

4 蛋白质组学筛选乳头抽吸液中的差异表达蛋白

乳腺液在乳腺导管中产生，其中含有乳腺上皮细胞[24]，可通过真空抽吸收集，相对难以获得并且会引起患者不适，所以乳头抽吸液(nipple aspirate fluid, NAF)蛋白质组学并不是目前的主流研究方向，近年来相关研究也较少。Brunoro等[25]通过SDS- PAGE和2D- DIGE评估了来自7例单侧乳腺癌患者的14个配对NAF样本，结果表明，不同患者之间拥有非常不同的蛋白质组学特征，侵袭性较弱的肿瘤患者的NAF蛋白表达谱具有相似的均一性，更具侵袭性的肿瘤患者之间则具有异质性。在此基础上，2019年Brunoro等[26]对乳腺癌及其配对的对照NAF样本进行分析，总共鉴定和定量了1 227种蛋白质，其中87种差异显著，并且在这些差异蛋白中发现参与细胞- 基质沟通、糖酵解(Warburg效应)和免疫系统激活的蛋白质含量较高。该研究加深了人们对肿瘤微环境的认识，有助于了解乳腺癌的发生发展，评估预后[26]。Shaheed等[27]从8个NAF样品的2D- LC/MS分析中总共鉴定出1 990种独特的蛋白质，其中许多是已建立的癌症相关标记，这些蛋白质在组织稳定性、细胞黏附和细胞间通讯中发挥作用，未来的NAF蛋白质组学分析将致力于研究癌细胞增殖并迁移到周围的正常组织环境时，蛋白质的变化是否与基质破坏和降解有关。

5 蛋白质组学筛选唾液中的差异表达蛋白

唾液是一种非侵入性生物流体，可以反映生命个体局部和整个系统健康状况，唾液收集对患者而言安全无痛苦，并且方便、容易。唾液蛋白质组学是乳腺癌诊断的一个新领域。Giri等[28]对转移性乳腺癌和卵巢癌进行全唾液蛋白质组学检测，共鉴定出646种蛋白质，在转移性乳腺癌和卵巢癌患者中均发现了与转移相关的蛋白如coronin- 1A，、TPT- 1、VASP、HSP90α、cofilin及Arp 2/3，这些蛋白和癌症的嗜有机性相关，另外，转移性乳腺癌患者中大多数上调的蛋白质在功能上互相关联，这表明它们比卵巢癌更具侵袭性。

6 蛋白质组学筛选尿液中的差异表达蛋白

在传统观念中，尿液检查一般是用来帮助诊断泌尿系统疾病的，与之相关的尿液蛋白质组学备受关注[29- 30]，而在乳腺癌研究中这项技术才刚刚起步。一项针对148名女性的研究[31]显示，尿液中MMP- 9和ADAM- 12含量高的女性发生非典型增生的可能性比正常对照组高5倍，发生小叶癌的可能性高13倍，这两个指标可以用来预测发生乳腺癌的风险。另有研究[32]表明，使用无标记LC- MS/MS的蛋白质组学检测到的大量丰富的乳腺癌尿蛋白都是分泌蛋白，在鉴定出的59种重要尿蛋白中，揭示了13种新型上调蛋白的列表，可用于创建一组靶标，构成尿液筛查“试纸”测试的一部分，以检测乳腺癌。Gajbhiye等[33]则使用了基于凝胶和无凝胶的互补定量蛋白质组学方法，找到了一组尿蛋白标志物，可以将HER2亚型乳腺癌与健康对照区分开，这些蛋白可以成为无创性候选靶标并帮助我们了解乳腺癌的病理生理过程。

7 展 望

最近，随着技术的进步，基于MS法的蛋白质组学研究蓬勃发展，经过筛选的差异表达蛋白不仅可以重新定义不同的乳腺癌亚型，还可以作为乳腺癌的筛查指标和治疗靶点，实现乳腺癌早期诊断、精准治疗的目标。但是，由于临床样本不易得到，蛋白质组学相关技术精湛，价格昂贵，大规模的临床研究相对少见，所以虽然目前已经有很多乳腺癌相关蛋白质组学的研究成果，仍需扩大样本进行多中心的实验进一步验证实验结果，才能真正应用于临床，惠及更多的乳腺癌患者。