炎症小体在重症急性胰腺炎中的研究现状

杜祖超 李鑫健 张占田 白凯淞 白雪巍

1哈尔滨医科大学第一附属医院胰胆外科，哈尔滨 150081；2哈尔滨医科大学肝脾外科教育部重点实验室，哈尔滨 150081

【提要】 炎症小体是多蛋白组成的胞质复合体，通过调控caspase-1介导的促炎因子激活来增强对病原体或应激原的免疫应答，其激活失控可导致系统性炎症反应。目前胰腺损伤与炎症级联反应启动的耦联机制仍不明确，而炎症小体的发现为SAP病因研究提供了一个新视角。本文就炎症小体激活在SAP病程中发挥的作用及其潜在治疗策略进行综述。

SAP是由外分泌胰腺损伤诱发的局部和系统性炎症反应，目前仍缺乏特异性的抗炎治疗。近年来由感染或应激因素导致的促炎程序性细胞死亡机制逐渐被阐明[1]，如坏死性凋亡(pyronecrosis)和焦亡(pyroptosis)[2]，这类受调控的死亡方式可能既是免疫细胞控制局部感染的防御途径，也是SAP早期炎症反应扩散的原因[3]。其中由炎症小体激活半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)是介导细胞焦亡的主要途径，caspase-1作为炎症小体经典途径招募的效应蛋白[4]，通过裂解膜穿孔蛋白gasdermin D形成氨基端(N端)和羧基端(C端)结构域，随后其N端结构域在细胞膜形成10～20 nm的孔隙[5]，诱导细胞焦亡并释放IL-1β、IL-18等炎症递质，调节机体免疫应答。以往研究发现caspase-1主要在巨噬细胞和树突状细胞激活[6]，但近期研究提示腺泡细胞[7]和胰岛细胞[8]也可能存在炎症小体激活过程和焦亡现象，电镜下观察腺泡细胞焦亡的形态特点包括胞质肿胀、胞核固缩，最终导致胞膜破裂，大量胞质内容物溢出[9]。因此，深入探讨SAP病程中炎症小体激活途径以及由其介导的腺泡损伤和免疫反应失衡机制，有助于找到遏制炎症级联反应的潜在靶点。

一、SAP病程中炎症小体的激活

炎症小体是一组调节炎症递质激活的胞质蛋白复合体，参与其组装的模式识别受体包括含核苷酸结合寡聚结构域(nucleotide-binding oligomerization, NACHT)样受体(NLRs)、黑色素瘤缺失-2(absent-in-melanoma-2, AIM2)样受体(ALRs)和维甲酸诱导基因-I(retinoic acid-inducible gene-I, RIG-I)样受体(RLRs)等[10]。其中NLRs家族的热蛋白结构域3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing 3, NLRP3)炎症小体在胰腺急、慢性炎症以及肠黏膜屏障功能的调节中均发挥重要作用[11]，而NLRP6炎症小体主要参与黏膜免疫，维持肠道微生态的稳定性[12]。尽管功能有所不同，NLRs家族却有着类似的结构，包括C端的富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat domain, LRR)结构域、中心的NACHT结构域以及N端招募caspase的结构域。LRR主要负责感知上游信号，激活后的NLRP通过NACHT结构域进行寡聚并通过N端热蛋白结构域(pyrin domain, PYD)招募接头蛋白即凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain, ASC)，随后ASC的caspase激活与募集结构域将pro-caspase-1募集在复合体内，形成完整的炎症小体[13]。NLRP-ASC-caspase-1复合体中3种蛋白成分相互调控，在合适的状态下激活免疫反应。AIM2炎症小体最近也被证实与SAP的无菌性炎症反应和病情严重程度相关[14]。AIM2炎症小体主要由N端PYD和C端具有200个氨基酸重复序列的造血干扰素诱导核抗原结构域(hematopoietic interferon-inducible nuclear antigens with 200 amino acid repeats, HIN200)组成，HIN200识别胞质双链DNA后由PYD募集ASC介导下游反应[15]。

目前研究表明NLRP3炎症小体激活过程包括合成及效应阶段，除了病原相关分子模式以外，胞膜通透性改变和离子流动(如Ca2+内流、K+外流)、内质网应激、溶酶体破裂、线粒体损伤、自噬缺陷等细胞事件以及活性氧(reactive oxygen species, ROS)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)、游离脂肪酸、尿酸等代谢物堆积均与其激活相关，并且它们之间存在复杂的交互作用[10]。Hoque等[3]依次敲除小鼠炎症小体成分caspase-1、ASC、NLRP3以及Toll样受体TLR9/TLR3、嘌呤受体P2X7，通过与雨蛙素诱导的野生型小鼠对比，证明SAP早期炎症反应产生及发展需要NLRP3炎症小体参与，其中胰腺损伤所释放的核酸(胞核或线粒体DNA)及ATP作为损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMP)分别作用于巨噬细胞的TLR9受体和P2X7受体，参与NLRP3炎症小体的激活。TLR9激活可作为炎症小体合成的启动信号，受到配体刺激的TLR通过MyD88-IRAK-TRAF6通路激活IκB激酶(IκB kinase, IKK)复合体，进而导致IκBα磷酸化解离或降解，胞质的NF-κB得以解除抑制向细胞核转移，促进NLRP3和白介素前体合成[16]。炎症小体组装及发挥效应所需第二信号尚无定论，有假说认为众多刺激信号并未直接与NLRP3结合，而是通过膜通透性改变介导的跨膜离子流参与其激活过程，其中K+外流作为炎症小体激活的独立触发因素近年来逐渐受到重视[17]。Di等[18]证明P2X7在感受DAMP刺激后作为非选择性阳离子通道介导Ca2+、Na+等内流，内向电流产生的膜电位差在双孔结构域内向整流钾通道(TWIK2通道)协同作用下介导K+外流，胞质离子分布改变激活了NLRP3炎症小体，并且阻断TWIK2通道，可显著减轻小鼠巨噬细胞介导的肺损伤。Vyleta等[19]提出应激信号诱导的线粒体ROS产生和K+外流等可能通过促进翻译起始2α或延长因子2的磷酸化，抑制核糖体功能，进而激活NLRP3炎症小体。目前多数激活途径是依据感染性动物模型提出的，而SAP早期以无菌性炎症为主，因此炎症小体在不同病因SAP中的激活过程仍需要进一步深入研究。此外，肠道微生物相关分子模式在炎症小体激活过程中的作用也是近年来的研究热点。Li等[20]的实验证明急性坏死性胰腺炎小鼠的肠道菌群与NLRP3炎症小体存在交互调控，AP期间条件致病菌(埃希-志贺菌属及肠球菌属等)丰度增加导致NLRP3炎症小体激活，而NLRP3激活又加重了肠道菌群紊乱和肠黏膜屏障损伤，敲除NLRP3的小鼠菌群失调及炎症反应明显减轻。该研究结果提示肠黏膜NLRP6炎症小体在SAP肠源性感染中是发挥协同还是拮抗作用有待进一步研究。

二、炎症小体对SAP局部和全身炎症反应的调控

Hoque等[3]研究表明，SAP中NLRP3炎症小体激活是多条通路协同作用的结果，被配体激活的TLR4、TLR9通过NF-κB通路诱导NLRP3表达并同时促进巨噬细胞诱导IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎症因子前体蛋白的合成[16]，在各种应激原作用下NLRP3寡聚并进入效应阶段，即募集活化caspase-1并促进IL-1β、IL-18、高迁移率族蛋白1 (high-mobility group box-1, HMGB1) 前体的成熟和释放[21]。在细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等诱导下，由caspase-11介导的非经典途径也参与炎症小体激活和IL前体活化，但在人体并未得到证实[22]。生理状况下的NLRP3炎症小体激活可促进损伤组织的清除及修复，维持机体稳态，但其功能失调却与许多炎症和代谢性疾病相关。激活的caspase-1、caspase-11可通过切割活化gasdermin D诱导细胞焦亡，同时促进炎症因子释放到胞外[5]，并且焦亡细胞的胞质内容物作为DAMP继续激活免疫系统，导致炎症反应级联放大。此外，有研究表明焦亡的单核巨噬细胞以微泡形式释放组织因子[23]，触发全身凝血功能异常。

Sendler等[24]通过对急性坏死性胰腺炎小鼠脾、系膜淋巴结的淋巴细胞和体外骨髓来源巨噬细胞(与雨蛙素刺激腺泡共培养)进行流式细胞及转录组分析，证实NLRP3炎症小体在调控机体促炎和抗炎反应中发挥关键作用。由此可见，早期胰腺损伤激活的免疫反应受到自身限制，M1巨噬细胞清除坏死腺泡细胞的同时激活NLRP3炎症小体，从而促使炎症因子成熟和释放。分泌到胞外的IL-1β促进IL-6、TNF-α的促炎作用，而IL-18介导中性粒细胞成熟和局部浸润，同时诱导适应性免疫向Th2/Treg方向转化(缺乏由LPS诱导的IL-12情况下)。Th2细胞分泌的IL-4、IL-13进而诱导巨噬细胞向M2方向分化，促使免疫系统产生抗炎反应及组织纤维化。Schmidt等[25]解释了SAP急性期的SIRS导致器官功能衰竭，而代偿性抗炎反应则导致坏死组织感染和脓毒症，二者可能是平行进展的过程，炎症小体介导的促炎和抗炎反应失衡可能与临床SAP患者两个死亡高峰期相关。但以上结果是基于SAP提出的，轻症和中度重症AP的免疫反应谱还需进一步阐明，以揭示病程由轻症向重症转化的机制。

三、基于炎症小体的治疗策略

1．炎症小体抑制剂：NLRP3复合体的直接抑制剂包括MCC950、OLT1177、曲尼斯特以及CY-09等[11]，其中以MCC950研究最广泛，它通过抑制ASC寡聚及复合体ATP酶活性进而阻断caspase-1活化，抑制IL-1β、IL-18激活，从而减轻对急性坏死性胰腺炎小鼠的促炎及抗炎反应[24]。冬凌草甲素是从中药冬凌草提取的贝壳杉烯二萜类化合物，通过作用于NLRP3炎症小体的NACHT结构域阻断其激活，同时抑制上游NF-κB通路，在多种炎症性疾病中显示出良好效果，是较有潜力的候选药物[26]。炎症小体间接抑制剂包括格列本脲、16673-34-0、JC124等，下游caspase-1抑制剂包括小白菊内酯、VX-740和VX-765等，针对底物IL-1β、IL-18的单抗已经应用于相关自身免疫疾病治疗，其在SAP中的疗效有待进一步验证[11]。此外，Guarda等[27]的实验表明Ⅰ型干扰素(type I interferons, IFN-I)通过STAT1转录因子抑制NLRP3激活，并通过STAT3抑制IL-1前体合成，这为IFN-I应用于炎症小体相关疾病提供了理论基础。

2．炎症小体上游信号阻断剂：炎症小体的上游包括转录合成所需的第一信号和组装活化所需的第二信号[28]。Greten等[29]通过抑制或敲除IKKβ阻止NF-κB激活，实验小鼠由内毒素介导的炎症反而加重，这可能来源于其他通路对IL-1β的合成代偿性增加，提示长时间抑制NF-κB通路可能会使IL-1β的激活不依赖于炎症小体途径。阻断NLRP3激活第二信号的阻断剂很多，主要包括(1)自噬参与溶酶体对损伤细胞器和大分子物质的分解代谢，白藜芦醇能够通过诱导细胞保护性自噬和维持线粒体稳定性来抑制NLRP3激活，并促进炎症小体及其下游蛋白降解[30]。(2)TWIK2通道介导的K+外流是NLRP3激活的独立因素，奎宁可特异性阻断TWIK2通道并减轻巨噬细胞诱导的炎性损伤[18]；β-羟基丁酸是酮体代谢产物，能通过抑制K+外流及ASC寡聚阻断NLRP3激活[31]。(3)和厚朴新酚是来源于厚朴的双酚化合物，其通过抑制线粒体ROS阻断炎症小体激活[32]。此外，直接拮抗Toll样受体也可明显抑制NLRP3激活，如TLR9拮抗剂IRS954可显著减轻AP小鼠的胰腺坏死和肺部炎症[3]，乳酸盐(如乳酸钠林格等)可通过乳酸受体GPR81(G-protein-coupled receptor 81)抑制TLR4、TLR9介导的NLRP3激活和炎症因子释放[33]。

3．非编码RNA对炎症小体的表达调控：微小RNA(microRNA，miRNA)通过靶向信使RNA抑制特定基因表达。研究表明miR-20b-3p的水平升高能够抑制TXNIP介导的NLRP3炎症小体激活过程，减轻炎症反应[34]。此外，miR-223可直接结合NLRP3转录本3′UTR保守位点抑制其表达，miR-223缺失的小鼠对内毒素的易感性显著提高[35]。miR-133a-1则通过抑制线粒体解耦联蛋白2(uncoupling protein 2, UCP2)表达进而促进炎症小体效应蛋白caspase-1及IL-1β激活[36]。因此，对miRNA的调控可能有助于阻止SAP早期的炎症级联反应。

综上所述，炎症小体被损伤腺泡细胞所释放的DAMP激活，通过促进巨噬细胞分泌IL-1、IL-18以及HMGB1参与固有免疫反应，并调节适应性免疫向Th2/Treg方向转化。抑制NLRP3炎症小体激活可有效减轻SAP期间的炎症反应，但过度抑制固有免疫可能会导致后期感染并发症增加。因此，对于炎症小体的调控，应避免过犹不及，抑制强烈促炎反应带来的SIRS的同时，应避免代偿性抗炎反应造成的坏死组织感染，以重新建立免疫系统平衡状态为治疗目标。同时应充分发挥我国传统中医学优势，为遏止轻中症AP向重症转化提供可行方案。进一步开发安全有效的靶向NLRP3抗炎药物不仅能为SAP患者带来获益，也能为炎性肠病等其他免疫相关疾病长期缓解带来新希望。

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