温阳活血汤治疗骨转移癌作用机制探讨

杨梦霞，毛 昀，周 磊，朱世杰，王宁军，芦殿荣

(1.北京中医药大学，北京 100029 2.中国中医科学院望京医院，北京 100102)

骨转移癌是乳腺、肺和前列腺癌等恶性肿瘤常见并发症，可引起疼痛、脊髓压迫、病理性骨折等一系列临床表现，给晚期肿瘤患者的生存质量带来了严重不良影响[1]。目前多采用手术、放疗、双膦酸盐类药物治疗等延缓骨转移，但总体疗效欠佳，且不良反应明显[2]。近年来中医药以其副作用少、疗效佳等优势在骨转移癌治疗中取得了较好的临床效果，在临床上受到了广泛关注[3]。骨转移癌属于中医学骨痹、骨蚀、骨瘤、胫阴疽等范畴，其病机多为正虚邪实。其中正虚多为肾虚、阳虚，邪实多为寒、痰、血瘀和癌毒等，故在治疗上应重视扶正，并联合温阳活血、散寒化痰，攻毒抑癌等方法[4]。基于此，我院自拟温阳活血汤治疗阴寒凝滞型骨转移癌，取得了较好的临床疗效，但尚未对其作用机制进行研究。近年来网络药理学因其融合了系统药理、生物学及计算机信息学等内容的独特优势，发展迅速，可通过多层次相互作用的中药、化合物、靶点、疾病基因和信号通路网络示意图的构建来探讨中医药作用机理，是较为全新的一种方法。本研究拟运用网络药理学方法探讨温阳活血汤治疗阴寒凝滞型骨转移癌的分子机制，以期能够在基础研究中为后来学者提供新思路，在临床上为医生用药提供一定参考价值。

1 资料与方法

1.1温阳活血汤有效成分的筛选:在数据库TCMSP中，以口服生物利用度OB、类药性指数DL分别不小于30%和0.18为筛选条件，收集温阳活血汤8味中药化合物成分；此外，以TCMID、TCM Database@Taiwan为补充数据库，并联合文献数据库如知网、万方等检索温阳活血汤相关成分。

1.2药物有效成分作用靶点的预测:使用数据库TCMSP查找主要有效成分相关靶蛋白,并结合Uniprot数据库查询其对应的Gene Symbol；在PubChem中获取化合物有效成分的SMILES结构，并在数据库Swiss Target Prediction中将上述获得的结构输入，且以“Homo sapiens”为筛选条件进行相关靶点的查询，保留匹配度高的靶点，之后将两个数据库中获得的靶点进行去重，并在MCODE插件中进行核心基因的筛选。

1.3骨转移癌潜在治疗靶点筛选:本研究将“Gene”和“Homo sapiens”设置为检索条件，在疾病基因数据库DisGeNet和Drugbank中寻找骨转移癌相关基因,最后去重。

1.4温阳活血汤治疗骨转移癌的主要潜在靶点:将药物相关作用靶点和疾病基因在Venny2.1中进行映射，筛选出温阳活血汤治疗骨转移癌的靶点有105个。之后在STRING11.0数据库中，输入上述靶点并将“Homo sapiens”作为选择物种，可获得PPI互作网络，并在Cytoscape3.6.0中进行可视化。

1.5靶基因的功能分析:在DAVID数据库中对温阳活血汤治疗骨转移癌的潜在靶点做GO和KEGG富集分析，其中GO分析包含了生物过程BP、细胞成分CC和分子功能MF。

2 结 果

2.1温阳活血汤主要活性成分:在数据库TCMSP、TCMID和TCM Database@Taiwan中检索到温阳活血汤所有化学成分共计707个。以OB、DL分别不小于30%和0.18为筛选阈值，并结合文献检索，合计有效成分共109个，见表1。

表1 温阳活血汤的主要有效成分

leonticineSexangularetin13-methylpalmatrubinebeta-sitosterolN-methyllaurotetaninesitosterolnorglaucing党参(21个)poriferasta-7,22E-dien-3beta-olPontevedrinePerlolyrinePseudocoptisineDiop24240-05-9ZINC03978781saulatineStigmasterolstylopine7-Methoxy-2-methylisoflavoneTetrahydrocorysamineSpinasteroltetrahydroprotopapaverineChrysanthemaxanthinST057701FrutinoneA2,3,9,10-tetramethoxy-13-methyl-5,6-dihydroisoquinolino[2,1-b]isoquinolin-8-oneluteolinStigmasterolTaraxerolPalmatinestigmast-7-enolFumarine3-beta-HydroxymethyllenetanshiquinoneIsocorypalminemethylicosa-11,14-dienoatebicuculline5alpha-Stigmastan-3,6-dioneC093677-(beta-Xylosyl)cephalomannine_qtquercetinDaturilin山慈菇(3个)beta-sitosterolglyciteinStigmasterolSpinosideA2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-4,5-diol(8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(E,2R,5S)-5-ethyl-6-methylhept-3-en-2-yl]-10,13-dimethyl-1,2,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclo-penta[a]phenanthren-3-one补骨脂(3个)Daucosterol11-Hydroxyrankinidineisobavachin炙黄芪(1个)beta-sitosterolStigmasterol

2.2温阳活血汤潜在治疗靶点:在数据库TCMSP和Swiss Target Prediction中检索温阳活血汤109个化合物的相关靶点，去重后保留高匹配度靶点，最终得到相关靶点374个。在数据库STRING11.0中获得374个相关靶点PPI网络，并在Cytoscape3.6.0中对此网络作可视化分析，发现此网络中包含节点369个和边数7623条。在MCODE插件中进行基因筛选，得到158个核心基因，位于A、B、C三个子簇，见图1。三个子簇包含的节点数分别为66、59和33；组成边数分别为1686、426和182。

图1 温阳活血汤潜在治疗靶点核心基因

2.3温阳活血汤治疗骨转移癌的主要潜在靶点:以“Bone metastasis”为检索词，在疾病基因数据库DisGeNet和Drugbank中最终得到773个靶基因，与药物374个相关靶点进行映射，见图2；最后获得105个温阳活血汤治疗骨转移癌的靶点，见图3A。节点连接度Degree数值越大，说明有越多条边与该节点相连，即该靶点越重要。据此，筛选出Degree值位于前25的关键靶点，见图3。

图2 温阳活血汤治疗骨转移癌的潜在治疗靶点和骨转移癌疾病靶点的韦恩图

图3 温阳活血汤治疗骨转移癌的105个靶基因(A)及核心基因(B)

2.4温阳活血汤治疗骨转移癌靶基因的GO功能分析:在数据库DAVID中对105个潜在治疗靶点进行GO功能富集分析，共得到143条结果，其中BP、CC和MF分别涉及88项、11项和44项。以错误发现率FDR<0.05为筛选条件，获得100个条目，其中BP63项、CC5项、MF32项，将BP、MF的前10项和CC的前5项绘制成气泡图来进行富集分析，见图4。在BP方面，包括脂多糖介导的信号通路、5-羟色胺受体信号通路和细胞对血管内皮生长因子刺激的反应等；在CC中，涉及树突、内溶酶体腔、血小板α颗粒腔、受体复合物、蛋白质细胞外基质等；在MF方面，涉及G蛋白偶联的5-羟色胺受体活性、丝氨酸型内肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性和蛋白激酶活性等。

图4 温阳活血汤治疗骨转移癌靶基因的GO功能富集分析

2.5温阳活血汤治疗骨转移癌靶基因KEGG通路分析:通过对105个潜在治疗靶点做KEGG通路分析发现，与温阳活血汤治疗骨转移癌作用机理相关的通路有92条，以FDR<0.05为富集筛选条件，得到84条符合该条件的通路，取排名前25的通路在气泡图中进行富集功能分析，见图5。相关通路主要有HIF-1信号通路、TNF信号通路、VEGF信号通路、ErbB信号通路、Toll样受体信号通路、Rap1信号通路等。

图5 温阳活血汤治疗骨转移癌靶基因的KEGG通路富集分析

3 讨 论

现代医学认为骨转移癌发生机制与骨微环境和肿瘤细胞的相互作用有关，在转移过程中，成骨细胞、破骨细胞两者之间动态失衡所产生的环境，更加有利于肿瘤细胞的转移[5]。中医学认为罹患肿瘤的患者多处于邪正并存的状态，故在治则上应当扶正与驱邪并重，以改善机体状态[6]。自拟温阳活血汤中以干姜9g、肉桂10g和补骨脂20g温阳；以红花10g和延胡索20g活血；以党参30g、炙黄芪30g和山慈菇20g扶正以驱邪，全方八位中药共奏温阳活血之功，但其作用机制尚未明确。

通过筛选温阳活血汤的主要有效成分并构建多层次相互作用的成分与靶点相互作用网络示意图，发现槲皮素、豆甾醇、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚、黄芩素和β-胡萝卜素等为其核心化合物，且大多数能抑癌、抗炎和调节免疫系统。其中槲皮素作为关键化合物，一方面可以通过抑制RANK-L、RANK等蛋白以及IL-8，TNF-α等炎症介质的表达，增加OPG的水平，进一步降低PAR2/TRPV1通路中的相关分子(如PAR2,TRPV1等)和TNF-α和IL-1β的水平，最终使破骨细胞活化受抑、骨破坏程度得以下降[7]。豆甾醇和β-谷甾醇均可抑制脂多糖诱导的巨噬细胞产生和分泌多种炎症介质，如活性氧，一氧化氮和TNF-α，主要与NF-κB信号通路相关：其中TNF-α可通过对NF-κB激酶IKKβ的抑制功能来增加NF-κB，而NF-κB3抑制剂的泛素化可减少NF-κB[8]。木犀草素可通过抑制PCNA蛋白和MMP-9蛋白的表达及PI3K/AKT通路活化来阻碍宫颈癌HeLa细胞的增殖和迁移[9]。

通过Cytoscape3.6.0软件构建温阳活血汤治疗骨转移癌的蛋白互作网络示意图，发现VEGFA、AKT1、IL6、TP53、ALB、CXCL8、CASP3、TNF、EGFR、EGF和MAPK3等为其关键靶点。VEGFA具有调节血管生成和促进癌细胞增殖的作用，其通路受到HIF和JAK/STAT通路的调节，且VEGFA信号级联与MAPK通路有关[10]。促骨因子IL-6和TNF-α都可以刺激成骨细胞产生RANKL，可与RANK即破骨细胞前体表面的受体结合，刺激下游信号分子，包括MAPK和PI3K/AKT，并可对破骨细胞前体向功能性破骨细胞的转化起促进作用。CXCL8，也称为IL-8，通过与CXCR-1和CXCR2作用起调节炎症反应的作用。此外，有研究发现在肝癌组织中CXCL8上调，可增加ERK、p-ERK和凋亡抑制基因Survivin的表达，降低CASP3和BAX的表达，从而使癌细胞增殖和迁移能力增加[11]。

根据GO和KEGG富集分析结果可以发现，温阳活血汤治疗骨转移癌的作用机制主要包含抑癌，调节骨微环境和肿瘤细胞等方面。当骨微环境缺氧时，HIF-1可启动缺氧基因的转录，这些基因对血管生成、肿瘤细胞凋亡和生长因子/细胞因子活性至关重要。此外，HIF-1还可与生长因子/细胞因子(如VEGF,EGF等)相互作用，这些因子在癌细胞上的表达可进一步促进癌细胞的增殖和转移[12]。有研究表明，在缺血性坏死骨组织中TNF-α表达显著上调，可激活p38MAPK/NF-κB信号通路。而抑制p38mapk/NF-κB通路可减弱TNF-α诱导的自噬作用，并增强TNF-α诱导的成骨细胞凋亡[13]。此外，也有研究发现，长非编码RNA的SPRY4内含子转录1可通过TNF信号通路促进肝细胞癌的进展和转移[14]。Toll样受体(TLR)可调节机体免疫功能和细胞代谢，其中TLR4是TLR家族中最具代表性的成员，包含两条信号通路：一是MyD88依赖型通路，可通过催化TRAF6泛素化启动NF-κB和MAPK表达,促进炎性细胞因子释放；二是MyD88非依赖型通路，该通路可通过活化NF-κB以促进炎性因子释放，也可激活干扰素诱导基因IP-10与调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子[15]。

综上所述，基于网络药理学研究方法，可发现温阳活血汤有效化合物为槲皮素、豆甾醇、木犀草素等，可通过HIF-1、TNF、VEGF等信号通路调控VEGFA、IL6、TNF等靶点，进而发挥抑癌、抗骨转移和调节免疫系统的作用，对临床上治疗骨转移癌用药具有一定参考意义，但仍需后期基础实验加以验证。