衰老性骨质疏松症小鼠胫骨组织差异表达miRNA筛选及生物信息学分析

黄高翔，韦灿燊，苏晓雪，黎婧，郭蓁，黎静

1广西医科大学基础医学院生理学教研室，南宁530021；2广西医科大学基础医学院人体解剖学教研室；3广西医科大学基础医学院转化医学研究中心长寿与老年相关疾病教育部重点实验室

骨质疏松症是以骨量降低、骨组织微结构破坏为特征的全身性骨骼疾病[1]。骨吸收、骨形成在空间和时间上是偶联的，如果骨吸收过度而骨形成不足，就会导致骨质疏松。衰老性骨质疏松症是年龄增长引起的以骨吸收大于骨生成为特征的进行性代谢性疾病。miRNA参与调节骨骼的形成、重塑、代谢等各个过程，与骨质丢失等骨骼相关疾病密切相关[2-3]。但是，以往研究主要集中在绝经后骨质丢失和骨质疏松症的miRNA表达谱[4-5]，针对衰老性骨质疏松症miRNA表达谱的研究较少，对于衰老性骨质疏松症的基因谱及生物信号通路网络的相关机制尚不清楚，明确衰老性骨质疏松症的分子机制成为亟待解决的问题。2018年6月—2021年6月，本研究筛选了衰老性骨质疏松症小鼠胫骨组织中差异表达的miRNA，并进行生物信息学分析，进一步探讨miRNA在衰老骨组织进展中的分子机制，为临床治疗骨质疏松症提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 3月龄雄性BALB/c小鼠40只由广西医科大学实验动物中心提供，体质量24～28 g。D-半乳糖、PBS购自北京索莱宝科技有限公司。RNasey mini试剂盒购自德国恰根公司。

1.2 小鼠模型制备 小鼠随机分为对照组和衰老组，每组20只。衰老组小鼠每天皮下注射D-半乳糖(200 mg/kg)，对照组小鼠每天皮下注射等量PBS。3个月后戊巴比妥钠深度麻醉小鼠，取两侧胫骨组织进行HE染色观察和显微CT分析。与对照组相比，衰老组胫骨骨小梁较细、较稀疏，连接较少；衰老胫骨的骨密度(BMD)、骨小梁相对容积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)水平显著降低，骨小梁分离度(Tb.Sp)显著升高(P均<0.05)，说明衰老组衰老性骨质疏松症小鼠模型建立成功。见表1。

表1 两组小鼠胫骨骨组织微结构参数比较

1.3 RNA提取 从两组小鼠胫骨中提取出总RNA，采用RNasey mini试剂盒纯化RNA，检测RNA浓度后，采用凝胶电泳法检测RNA的完整性。

1.4 胫骨组织差异表达miRNA分析 小鼠胫骨组织miRNA表达谱分析委托上海康成生物工程有限公司完成，使用miRCURY LNA Array系统对骨样本进行miRNA表达谱分析。RNA样本标记和杂交后，用Axon Gene Pix4000B微阵列扫描仪获得原始数据，差异表达miRNA的筛选条件为|logFC|>1.5、P<0.05。

1.5 胫骨组织差异表达miRNA的靶基因功能分析 采用TargetScan(http://targetscan.org/)和miRDB(http://mirdb.org/miRDB)预测胫骨组织差异表达miRNA的靶基因，利用VEEN图把2个数据库预测的靶基因取交集。将靶基因导入DAVID6.8(http://david.ncifcrf.gov)在线数据库，物种限定为小鼠，进行GO富集分析，研究靶基因的生物功能；进行KEGG通路分析，研究靶基因相关信号通路。将靶基因导入STRING数据库(https：//string-db.org/)，限定研究物种为小鼠，并设置medium confidence>0.4，其他默认设置，获得靶基因编码蛋白的相互作用关系。采用Cytoscape3.7.2软件的Bisogenet和CytoN-CA插件，筛选富集程度高的相互作用关系，构建miRNA-靶基因—蛋白调控网络。

2 结果

2.1 两组胫骨组织差异表达miRNA 两组有20个差异表达的miRNA。衰老组较对照组表达上调的miRNA有8个，分别为miR-5617-5p、miR-10a-3p、miR-3071-5p、miR-16-2-3p、miR-125b-1-3p、miR-344i、miR-181a-1-3p、miR-1934-3p；表达下调12个，分别为miR-211-3p、miR-31-3p、miR-5619-3p、miR-370-5p、miR-450b-3p、miR-96-5p、miR-5136、miR-344d-2-5p、miR-376b-3p、miR-411-5p、miR-15b-5p、miR-499-3p。

2.2 胫骨组织差异表达miRNAs的靶基因预测 TargetScan数据库预测得到2 953个靶基因，miRDB数据库预测得到4 158个靶基因。利用VEEN图取交集，得到1 130个靶基因。

2.3 胫骨组织差异表达miRNAs的靶基因GO分析结果 GO分析结果显示，分子功能方面，靶基因主要在酶结合、蛋白结合和DNA结合等方面发挥作用；细胞组分方面，多数靶基因涉及细胞连接、液泡和突触等；生物过程方面，靶基因主要参与蛋白质定位、蛋白质转运和信号调节等。见表2。

表2 衰老组胫骨组织中差异表达miRNA的靶基因GO分析结果

2.4 胫骨组织差异表达miRNAs的靶基因KEGG分析结果 衰老组胫骨组织差异表达miRNAs的靶基因主要调节MAPK信号通路、FoxO信号通路、Ras信号通路等。见表3。

表3 衰老组胫骨组织中差异表达miRNA的靶基因KEGG通路分析结果(前10位)

2.5 miRNA-靶基因—蛋白调控网络分析结果 两组差异表达的miR-96-5p、miR-5617、miR-15b、miR-3071与靶基因MAP2K1、UBE2G1、P4HB、VDAC1、CD164有紧密联系。而且，这些靶基因编码蛋白具有相互作用关系。

3 讨论

miRNA是由DROSHA酶在细胞核中把初级miRNA加工成前体miRNA，再通过DICER酶在细胞质中进一步加工，上述miRNA与Argonaute蛋白一起组成RNA诱导沉默复合体，其中一条链被选择成为成熟的miRNA。成熟的miRNA通过与互补的靶基因mRNA结合，导致mRNA翻译抑制或降解，最终降低靶蛋白表达。miRNA具有组织特异性、高度保守性和时序性，对细胞和组织的功能起着重要的调控作用。越来越多的证据表明，各种miRNA通过靶向参与成骨细胞和破骨细胞分化过程的主要转录因子和信号通路，最终影响骨的形成和重塑，从而对成骨细胞、破骨细胞分化起着至关重要的作用[6-8]。同时，许多miRNA是不同细胞和组织衰老过程中不可缺少的调节因子，并与心血管疾病、肿瘤和阿尔茨海默病等疾病有关。因此，miRNA在老年性疾病的诊断、治疗和预后方面具有广泛的应用前景。

骨质疏松症动物模型有老年性骨质疏松症模型和绝经后骨质疏松症模型，其中构建老年性骨质疏松症模型的方法包括自然衰老导致的骨质疏松症模型、D-半乳糖诱导的衰老性骨质疏松症模型等[9]。而D-半乳糖诱导衰老动物模型已被广泛应用于许多研究[10]。据报道，对Wistar大鼠进行D-半乳糖处理12周后可出现骨质流失表现[11]。骨质疏松症早期没有明显临床特征，而BV/TV、Tb.N、Tb.Th等指标可以反映早期骨质疏松症的骨流失，因此骨小梁相关特征是评估骨质疏松较好的指标。显微CT提供的高分辨影像能分析出更全面的骨骼参数，因而被广泛应用于观察骨小梁结构。本研究采用显微CT对D-半乳糖诱导的小鼠衰老性骨质疏松症模型进行分析，与对照组相比，衰老组小鼠出现了BMD、Tb.N、Tb.Th降低及Tb.Sp升高等骨质疏松的相关表现。在对骨组织进行HE染色分析后发现，与对照组相比，老年骨中胫骨骨小梁较细、较稀疏，结果与显微CT图像一致。

在建模成功后，本研究对对照组和衰老组骨组织进行miRNA芯片检测，与对照组相比，衰老组表达上调miRNA有8个(mmu-miR-5617-5p、mmu-miR-10a-3p、mmu-miR-3071-5p、mmu-miR-16-2-3p、mmu-miR-125b-1-3p、mmu-miR-344i、mmu-miR-181a-1-3p和mmu-miR-1934-3p)，表达下调的miRNA有12个(mmu-miR-211-3p、mmu-miR-31-3p、mmu-miR-5619-3p、mmu-miR-370-5p、mmu-miR-450b-3p、mmu-miR-96-5p、mmu-miR-5136、mmu-miR-344d-2-5p、mmu-miR-376b-3p、mmu-miR-411-5p、mmu-miR-15b-5p和mmu-miR-499-3p)。其中，mmu-miR-96-5p的相对表达量与对照组比较显著降低。miR-96-5p被认为是年龄相关性骨丢失的潜在诊断标志物或治疗靶点。miR-96-5p可以通过直接抑制靶向osterix来调节成骨[12]，并且还可以通过靶向FOXO1来调节成骨细胞衰老[13]。在表达上调的miRNA中，miR-16-2-3p被证实在骨质疏松症患者的骨组织中表达增加，并可以通过直接靶向Wnt5A来阻断Wnt信号通路，抑制骨形成[14]。此外，miR-181a通过调节骨髓间充质干细胞中FasL蛋白表达，对骨髓间充质干细胞诱导的CD4+T淋巴细胞凋亡产生负调控作用[15]。在表达下调的miRNA中，miR-370不仅可以调节MC3T3-E1细胞中BMP-2的表达、促进细胞分化，还可直接靶向FOXM1，抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移。此外，miR-15b不仅可以通过直接靶向Smurf1作为成骨细胞分化的正向调节因子，还可以调控成骨细胞的增殖和凋亡。然而，其他差异表达miRNA在相关过程中的作用仍需进一步研究。

GO分析结果表明，差异表达miRNA的靶基因主要参与酶结合、蛋白域特异性结合、序列特异性DNA结合、细胞连接、蛋白质定位、大分子定位和蛋白质转运等过程，提示这些miRNA可能在骨老化过程中发挥重要作用。同时，KEGG通路分析结果表明，MAPK、FoxO、Ras等信号通路可受到这些靶基因的影响。例如，p38 MAPK通路对于体内正常骨骼形成是必不可少的。缺失任何MAPK途径成员编码基因Mkk3、Mkk6、p38a或p38b的小鼠，均出现骨质量和成骨细胞分化显著降低。p38α MAPK以衰老依赖的方式调节破骨细胞祖细胞的增殖、分化及骨重塑。还有研究表明，6个月大的p38αf/f突变小鼠出现骨质疏松症，与破骨细胞生成和骨吸收增加有关[16]。此外，FoxO途径在年龄相关骨骼退化中具有重要作用。随着年龄的增长，FoxO表达减少可能是骨关节炎的关键致病因素[17]。更重要的是，骨组织中活性氧水平随着年龄和性类固醇缺乏而增加，而FoxO蛋白通过增强抗氧化酶和减少H2O2积累来限制破骨细胞形成和骨吸收[17]。此外，Ras信号通路也可调节骨祖细胞增殖和骨形成。过度活跃的Ras/MAPK信号是神经纤维蛋白缺乏小鼠胫骨骨不连骨折的关键因素。因此，Ras/MAPK通路失调很可能也是骨矿化减少的重要原因。

此外，本研究通过miRNA及其靶基因网络调控关系找到了节点miRNA和靶基因，提示miRNA-96-5p、miRNA-5617、miRNA-15b和miRNA-3071可同时调控MAP2K1、UBE2G1、P4HB、VDAC1和CD164等多个靶基因，更重要的是这些靶基因的编码蛋白存在相互作用。这提示差异表达miRNA可能在调控骨老化过程中起重要作用。其中，MAP2K1是调控细胞周期和衰老的重要基因之一。UBE2G1是一种针对异常或短寿命蛋白质进行降解的重要物质[18]。VDAC1是一种调节细胞存活和死亡的多功能线粒体蛋白[19]。P4HB可抑制错误折叠蛋白的聚集，其敲除可能诱导细胞凋亡[20]。CD164是一种潜在的细胞生长促进剂，参与细胞增殖和凋亡。

由此可见，miRNA在衰老性骨质疏松症发生发展过程中可能具有重要作用，相关关键基因有望作为预防和治疗衰老性骨质疏松症的药物靶点。