外泌体在肝细胞性肝癌中的作用研究进展

刘兴晖 彭婷玮 杨 兰

肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中最常见的类型，具有发生率高、病死率高的特征[1]。HCC起病隐匿，并且缺乏敏感、特异的早期诊断方法，故常常漏诊。其次，HCC的高转移特性加速了疾病进展。目前针对HCC的治疗包括手术切除和放化疗干预(如索拉菲尼、射频消融术)，前者针对早期HCC患者，可以适当延长患者生存期，但HCC肝内复发和肝外转移的发生率较高。后者针对晚期HCC患者，但容易诱导肝癌细胞产生耐药性。因此，两种治疗方案的预后均不乐观。为了明确HCC的早期诊断、监测疾病的进展、评估预后及治疗方法的疗效，发现一些敏感而特异的HCC标志物是很重要的。大量研究表明,外泌体表面的膜结合分子，可被受体细胞识别并广泛参与细胞间的信息传递，参与肿瘤微环境的调节，包括肿瘤发生、转移及血管生成、免疫调节等过程[2, 3]。同时外泌体也会影响HCC的预后及治疗。

一、外泌体的生物学特性

活细胞可以通过分泌胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)与邻旁细胞或远端细胞进行信息交流。EV根据亚细胞来源分为两大类：一类是细胞质膜直接出芽形成、释放直径为100～1000nm的微囊泡;另一类是活细胞内多囊泡体(MVB)与细胞质膜融合后释放出一系列小囊泡，即外泌体(exosomes)，其直径为50～150nm[4]。

细胞质膜向内凹陷，在RAB5和RAB3介导下细胞质膜向内凹陷形成早期内体，进一步发育成熟形成晚期内体，在转运所需的内体分选复合体(ESCRT)的作用下向内侧出芽，形成包裹多个腔内小泡(IVB)的多囊泡体(MVB)。当MVB与细胞质膜融合后，腔内囊泡释放至细胞外，形成外泌体。几乎所有细胞都能分泌外泌体。肿瘤细胞来源的外泌体(tumor-derived exosome,TDE)携带一系列信号分子，包括蛋白质(膜蛋白、黏附蛋白、转录因子等)、核酸(DNA、mRNA、非编码RNA)和脂质(鞘磷脂、神经酰胺、胆固醇)[5]。

外泌体的分离方法较多，目前的金标准为差速超速离心法，还有一些其他方法如微流控技术、免疫亲和层析等。外泌体的鉴定方法有电镜下观察形态、粒径分析判断其粒子大小以及蛋白质印迹法检测特异性蛋白的表达[6]。

二、外泌体与肝癌

1.外泌体与肝癌的诊断：近年来，由于外泌体携带的生物分子与来源细胞具有一致性， TDE作为肿瘤分子标志物在肿瘤诊治中的应用得到了越来越多的关注。研究发现，与健康对照组比较，HCC患者血清中有19种miRNAs显著增加。其中，miR-210分泌由HCC细胞来源的外泌体介导，因此，miR-210也可作为HCC诊断的生物学标志物之一[7]。Pu等[8]研究发现， HCC患者血清中外泌体has-miR-21-5p和has-miR-144-3p表达水平显著高于慢性乙型肝炎(CHB)患者，ROC曲线显示，两者在HCC诊断上的表现优于甲胎蛋白，敏感度和特异性更高，作为肿瘤分子标志物具有良好的临床应用前景。

2.外泌体与肝癌的发生和发展：肿瘤微环境是由肿瘤细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、抗原递呈细胞以及细胞外基质、生长因子、炎性细胞因子等组成。不同细胞外泌体通过携带不同信号分子发挥细胞通讯作用，参与肝癌的发生、转移、血管生成以及免疫抑制型微环境构建。

(1)肿瘤发生：当癌基因表达过度活化或抑癌基因表达过度受抑时，细胞表现为增殖能力的过度增强和凋亡能力的过度削弱，进而导致肿瘤的发生。PTEN是一种抑癌基因，负向调控肿瘤的发生。有研究表明，肝癌细胞外泌体miR-155抑制邻旁或远端受体HCC细胞中PTEN表达，活化PI3K/AKt信号通路以促进HCC细胞的增殖[9]。Zhang等[10]研究发现，HCC患者血清中脂肪细胞来源外泌体circDB表达水平上调，通过与HCC细胞中miR-34a结合，上调去泛素相关分子USP7的表达，通过减少细胞增殖过程中的DNA损伤来促进肿瘤发生。Mao等[11]在研究中提到了癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)调节HCC细胞增殖。转移性肝癌细胞来源EV中的NID1通过激活肺脏中的CAFs，促进其旁分泌肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)，进而诱导HCC细胞克隆的形成，表现出更加活跃的增殖能力。

(2)肿瘤转移：肿瘤转移是HCC发展过程中的关键环节，常常提示疾病朝着不良方向进展。外泌体中的信号分子通过细胞间信号交流介导上皮间质转化、血管渗漏等生物学过程，促进HCC的侵袭与肝外转移[3]。

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymale transition,EMT)是指肿瘤细胞在CAFs的影响下从上皮表型转化为间质表型，功能上体现为低增殖活性、高侵袭与迁移能力，形态上由上皮细胞的立方形、圆形转变为间质细胞的梭形、星形，细胞分子上体现为失去上皮表型标志(如钙黏蛋白)，获得间质表型标志(如α-SMA)[3]。Zhu等[12]研究发现，HCC细胞外泌体中circ-0004277表达水平上调，通过细胞通讯作用，提高癌旁正常肝细胞中circ-0004277的表达水平，进而诱导细胞发生EMT，促进HCC的肝内转移。Fang等[13]研究发现，肝癌细胞外泌体中高表达的miR-1247-3p进入肝成纤维细胞后，通过结合胞内B4GALT3抑制其表达，促进NF-κB磷酸化，成纤维细胞产生更多的IL-1β、IL-6和 IL-8等促炎性细胞因子，进而被活化为CAFs，促进肿瘤细胞发生EMT，侵袭力增加。

肿瘤细胞穿透血管内皮屏障在肿瘤转移中发挥关键作用。当血管通透性增强时，肝脏中的HCC细胞可穿过血管壁，进入血液循环中，随血流转移至全身各处，在适宜的靶器官中定植，形成肝外转移灶。血管内皮细胞能够摄取HCC细胞外泌体miR-103，通过抑制VE-钙黏蛋白、p120连接素和闭锁连接蛋白1合成，削弱内皮细胞间黏附连接与紧密连接的完整性，增加血管通透性，促进HCC细胞血管渗漏与侵袭转移[14]。除了削弱血管间的黏附作用以外，促进血管内皮细胞与HCC细胞间的黏附也能够介导HCC的高转移特性。细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)是一种能够显著增强内皮细胞与肿瘤细胞黏附作用的分子，CD90+Huh7细胞外泌体lncRNA H19上调内皮细胞ICAM-1表达，使得内皮细胞黏附更多CD90+Huh7细胞，以利于HCC细胞穿过内皮侵袭转移[15]。

(3)血管生成：新血管生成不仅能为肿瘤提供大量的氧气和营养，促进肿瘤的生长，还作为转移细胞进入体循环的入口点，介导肿瘤侵袭转移能力的增强。Lin等[7]研究发现HCC患者微血管密度与血浆miR-210表达水平具有明显相关性。研究发现，当肝癌细胞来源的外泌体miR-210与单层内皮细胞共孵育后， HCC细胞来源外泌体miR-210通过下调SMAD4和STAT6蛋白表达来促进毛细血管生成。肿瘤干细胞样CD90+肝癌细胞通过外泌体高水平表达lncRNA H19，显著增加促血管生成因子VEGF和相应受体VEGF-R1的释放，也能上调促血管生成作用[15]。Shao等[16]研究发现，HCC细胞来源EVs的miR-584-5p通过结合磷酸烯醇式丙酮酸激酶1(PCK1)抑制其活性，诱导核因子E2相关因子2(Nrf2)活化，上调血管内皮生长因子A(VEGFA)表达，促进内皮细胞增殖，增强血管生成能力。Wang等[17]认为，HCC细胞来源的外泌体中miR-1290富集，当其被血管内皮细胞内化后，能够抑制胞内SMEK1的表达，削弱其对VEGFR2磷酸化的抑制作用，从而诱导VEGFR2的活化和血管生成。除了非编码RNA介导血管生成外，蛋白质分子也可参与其中。血管紧张素转运蛋白(vasorin，VASN)是一种Ⅰ型跨膜蛋白，在肿瘤发生和血管生成中发挥重要作用。Huang等[18]研究发现，HepG2细胞外泌体高表达VASN，被受体HUVEC内化摄取后，内皮细胞的增殖能力增强，大量的内皮细胞聚集有利于血管生成。

(4)免疫调节：正常情况下，机体能够通过抗肿瘤免疫来清除体内癌细胞，但在肿瘤进展过程中，肿瘤免疫微环境由激活转为抑制，肿瘤细胞逃避机体的免疫破坏作用。巨噬细胞作为肿瘤免疫微环境中一类重要的免疫细胞，通过其表面配体与T细胞表面受体相互作用，介导肿瘤免疫抑制型微环境的形成。Tan等[19]研究发现，肝癌细胞外泌体中表达LOXL4蛋白质分子，并且能被骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)内化摄取，在BMDM成熟早期促进其向CD11b+F4/80+肿瘤相关巨噬细胞群(TAM)分化，铜依赖的H2O2产生通过激活IFN相关的信号通路，诱导STAT3和STAT1活化，增强TAM表面PD-L1分子的表达，巨噬细胞可通过PD-L1和CD86等细胞表面抗原与细胞毒性T细胞相互作用，抑制T细胞的活化，并促进TIM3阳性的CD4+和CD8+T细胞的耗竭，导致肿瘤免疫逃逸。根据活化方式不同巨噬细胞分为两种类型，一类是具有抗炎抗肿瘤活性的M1型，另一类是诱导机体产生免疫抑制，肿瘤细胞逃避免疫系统的杀伤破坏作用得以生存的M2型[20]。有研究表明，肝癌细胞来源外泌体中高表达lncRNA TUC339，被巨噬细胞内化摄取后，降低巨噬细胞产生IL-4等促炎性细胞因子的能力，吞噬作用减弱，介导巨噬细胞M2极化，促进HCC进展[21]。

3.外泌体与肝癌预后：HCC早期患者可进行肝切除术治疗，外泌体一些信号分子的表达与术后复发时间、总生存期长短、转移潜能等密切相关，可作为评估预后的指标。Wang等[22]跟踪随访183例行肝细胞癌切除术后的丙型肝炎病毒相关肝细胞性肝癌患者10年发现，这些患者血清外泌体中的分化拮抗非蛋白质编码RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR)的表达水平与HCC复发呈正相关，并且成为HCC复发和病死率相关的最具预测性的因素。另外一项研究发现，HCC患者外泌体miR-103表达与HCC的转移潜能和复发风险呈正相关，外泌体中miR-103水平高表达提示预后较差[14]。Jung等[23]检测并分析14例HCC患者(其中8例患者1年内没有发生肿瘤转移，6例患者发生肿瘤转移)血清外泌体的miRNA表达谱后发现，有61种miRNA在转移性HCC患者血清外泌体中表达显著上调，提示HCC的不良预后。

4.外泌体与肝癌治疗

(1)免疫治疗：树突状细胞(DC)因其具有极强的抗原递呈作用和激活抗肿瘤免疫的能力而越来越广泛地应用于HCC免疫疗法中，其诱导的肿瘤免疫强度很大程度上取决于肿瘤抗原的含量及特性，外泌体因其具有选择性富集来源细胞胞内成分的作用，故与肿瘤细胞碎片比较，肿瘤来源外泌体(TDE)作为抗原诱导DC活化的能力和肿瘤免疫强度更强。研究表明，HCC细胞衍生的外泌体中特征性肝癌抗原AFP和分子伴侣蛋白Hsp70显著增加，在体外能够被DC细胞内化摄取并促进DC细胞的成熟与活化，进一步放大TDE引发的免疫反应。同时，将TDE活化的DC细胞注入小鼠血清中发现，CD3+CD8+细胞毒性T细胞显著增多，CD25+FoxP3+CD4+调节性T细胞显著减少，产生免疫抑制性因子IL-10、TGF-β浓度显著降低，免疫活化性因子IFN-γ浓度显著升高，肿瘤免疫微环境得到了显著改善，由免疫抑制转变为免疫活化，为抗肿瘤免疫效应提供有利的环境条件[24]。

(2)作为药物运送载体：外泌体因其具有低免疫原性、低毒性、可进行人工修饰，并且能够自由穿过生物屏障的特点，是非常理想的药物输送载体。外泌体既可以包裹HCC化疗药物，通过外层脂质膜保护作用使其不容易被降解，延长其在机体内作用时间，也可以包裹提高HCC细胞对化疗药物敏感度的miRNA等，利于化疗药物在机体内发挥抑瘤作用。Zhang等[25]将阿霉素或索拉菲尼装载至红细胞来源的EVs中，该载药EVs可明显抑制小鼠原位肝癌细胞的生长,并且其对肝癌的抑制作用强于传统化疗药物给药方式及剂量所诱导的肝癌抑制作用。miR-122表达下调可激活IGF-1R进而活化RAS/RAF/ERK信号转导途径，介导HCC细胞对索拉菲尼耐药性的形成，过表达miR-122时可使得HCC细胞对索拉菲尼敏感而诱导细胞凋亡[26]。Lou等[27]在研究中用编码miR-122的质粒转染脂肪间充质干细胞(AMSC)后，产生的外泌体可通过分泌miR-122增加HCC细胞对索拉菲尼的敏感度。此外，外泌体还能够通过包裹抑制肿瘤细胞生长和侵袭的miRNA，使其转移到HCC细胞后逆转其恶性表型。人肝成纤维细胞miR-335-5p表达上调可抑制邻旁HCC细胞增殖，进而抑制肿瘤生成，CAFs外泌体分泌的miR-320a可作为一种抗肿瘤miRNA，与其下游靶点PBX3结合，抑制肝癌细胞的增殖、迁移[28，29]。因此，选择合适的外泌体装载这些miRNA，为HCC的靶向治疗提供了新的途径。

三、展 望

综上所述，不同细胞来源的外泌体携带不同的信号分子，通过靶向不同的受体或介导不同的信号转导通路参与HCC的发生、发展、转移和复发等，包括肿瘤发生、转移及血管生成和免疫调节，因此，通过对患者体液中外泌体蛋白质、非编码RNA等分子的检测和分析能够为癌症的早期诊断、预后评估和治疗方法的改善提供一定的参考和依据。但由于目前的外泌体分离方法无法获得完全纯化的外泌体，所以限制了外泌体作为HCC分子标志物的临床应用。今后应进一步研究外泌体的特性，以利于将外泌体与大小相近的凋亡小体和微囊泡区分开来。此外，目前外泌体携带信号分子通过细胞通讯介导HCC发生、发展的机制已经得到了充分研究，但外泌体的生成过程同样具有致瘤作用，因此，今后应致力于研究外泌体的生成在HCC的发生、发展中发挥的作用，使得HCC诊断的分子标志物与治疗途径更多样。