中性粒细胞胞外诱捕网及其在重症急性胰腺炎中的研究进展

杨 求 薛东波

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一种病死率极高的急腹症。当免疫系统功能增强时，引起的人体全身性炎症反应综合征将会导致MODS的产生。研究表明，SAP患者炎性损伤与中性粒细胞的活化与趋化密切相关,活化的中性粒细胞还可以通过释放NETs来参与捕获并杀灭病原菌[1]。NETs 由多种成分组成，其网状结构上附着的蛋白主要参与炎性反应[2]。NETs是一种全新的导致细胞死亡的机制，其存在可以补充吞噬作用机制，能够防止细菌逃逸，从而更好地杀灭病原体，保护宿主。在来自SAP小鼠模型的胰腺组织中，NETs加剧了胰腺组织的损伤。通过明确NETs与SAP之间的相关性，将有助于通过调控NETs来改善SAP患者的病情。因此，由于NETs与SAP之间的相互作用，针对NETs的研究可能会成为SAP治疗的关键点。

一、NETs的组成成分及作用

NETs是由去聚化的染色质DNA构成的基本骨架，其表面附着瓜氨酸化组蛋白(CitH3)、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、组织蛋白酶G(CG)、髓过氧化物酶(MPO)、细胞外冷诱导RNA结合蛋白(eCIRP)和其他蛋白质[3]。此结构使NETs可以通过这些毒性蛋白捕获并杀死病原微生物、真菌和寄生虫等[4]。

当用脂多糖(LPS)或其他诱导NETs形成的物质刺激多核中性粒细胞(PMN)时，PMN将首先失去核小叶并使染色质解聚以形成游离的DNA纤维网，这种结构的释放将导致核膜破裂，细胞质中的蛋白质将黏附至DNA纤维上，最终，NETs将在细胞膜破裂后释放[5]。在体外，由DNA纤维组成的NETs的网状结构通过将抗菌蛋白附着到这些入侵病原菌上结合并杀死病原体。在患有败血性血管内血栓形成的个体中观察到DNA与细菌缠结形成的血栓的存在，这证实了DNA纤维网可防止细菌在体内逃逸。研究表明，NE、MPO和组蛋白等几种特殊蛋白质除具有抗菌活性外，其与NETs的形成也密切相关，MPO和NE的缺乏会阻断NETs的形成[2]。

二、NETs的形成机制

根据是否需要活性氧(ROS)，将NETs的形成机制分为ROS依赖性和非ROS依赖性途径。

1.ROS依赖性NETs的形成：PMA诱导NETs形成的途径取决于ROS。PMA与细胞膜上的蛋白激酶C受体(PKC受体)结合并激活PKC。激活的PKC启动Raf-MEK-ERK(MAPK)途径，并随后激活NADPH氧化酶(NOX)，从而导致ROS产生[6]。ROS激活MPO，触发NE从嗜酸性颗粒活化转运到细胞核。NE转运到细胞核中水解染色质上的组蛋白，使染色质去组装形成游离的DNA复合物。组蛋白瓜氨酸化，这是由蛋白质精氨酸脱亚氨酶4(PAD4)介导的，最终导致染色体解聚形成NETs[7]。

多数病原微生物、炎性细胞因子和化学物质通过以下途径驱动NETs的形成，通过不同的上游受体[例如细菌致病因子的Toll样受体(TLR)、整联蛋白的G蛋白偶联受体(GPCR)等],从而激活NOX而形成的信号通路。作为该途径中最重要的物质，由PMN产生或由病原体分泌的ROS直接诱导NE从细胞质颗粒转移到细胞核，从而激活NETs形成所需的下游反应。

ROS依赖的NETs的形成同时也受到自噬的调节。通过Ⅲ型组织相容性复合体(MHC)蛋白受体，调节NETs的形成，自噬的抑制会阻止佛波酯(PMA)或LPS/IL-8诱导的NETs形成，这表明自噬在NETs形成中的重要作用[8]。

2.非ROS依赖性NETs的形成:钙离子是主要参与非ROS依赖性NETs形成的关键物质。钙离子载体直接激活PAD4和钙蛋白酶以诱导NETs释放而没有ROS生成，由于PAD4的活化取决于钙离子的存在，因此钙离子缺乏会破坏NETs的形成。除了钙离子的参与外，据报道核因子κB(NF-κB)还可以在不产生ROS的情况下调节尿酸诱导的NETs形成，表明NETs形成所需的下游核信号转导受NF-κB调节[9]。在没有NADPH氧化酶活化和ROS产生的情况下，也观察到了由血小板诱导的NETs形成。经LPS激活后，血小板表面的糖蛋白Ⅰb(GPⅠb)与嗜中性粒细胞上的β2-整联蛋白(CD18)结合，然后激活Src激酶PI3K-ERK途径，加速细胞周期进程，最终形成NETs[10]。

三、NETs与SAP之间的关联

中性粒细胞在与SAP相关的炎性损伤中起着至关重要的作用[1]。在严重水肿或坏死的胰腺区域发现嗜中性粒细胞浸润增加。NETs及其活化的中性粒细胞来源的成分也在受损SAP动物模型的组织中检测到，并加剧了SAP的恶化和炎性组织损伤[11]。这些结果证实了NETs与SAP之间的联系。研究表明，SAP患者的炎症性损害是由活化的NETs及其组成成分引起的[12]。

1.NETs与SAP的发生——细胞内胰蛋白酶的活化相关:在SAP小鼠模型胰腺组织中发现了NETs的存在，其在体内诱导胰蛋白酶活化、炎性反应和组织损伤,SAP胰腺组织与NETs共存会增加胰蛋白酶的活性[13]。无细胞组蛋白包括那些源自NETs的毒性蛋白，破坏胰腺腺泡细胞质膜，导致腺泡细胞质泄漏和细胞死亡。抑制eCIRP显著降低了NETs诱导的来自腺泡细胞的胰蛋白酶原分泌，这表明与NETs相关的eCIRP参与了炎性胰腺的蛋白水解激活。

2.NETs与SAP的进展——全身性炎症反应综合征相关：SAP的特征是胰蛋白酶原的异常激活后全身炎症的级联激活。酶原激活导致胰腺组织自消化和胰腺损伤。NETs组成成分中的eCIRP，可作为一种新型的损伤相关分子模式(DAMP)，通过蛋白水解消化(例如炎症性细胞因子降解)在NETs中降解潜在有害的DAMPs[14]。受损的腺泡细胞释放DAMP来促进细胞因子IL-1β的产生和细胞表面模式识别受体(包括TLR)的激活，最终导致SAP患者发生全身性炎症反应综合征，SIRS持续性发生将会导致多个器官衰竭。

3.NETs与SAP患者凝血功能异常相关:凝血纤维蛋白溶解异常导致弥散性血管内凝血(DIC)可能对急性胰腺炎的严重程度起重要作用。胶原蛋白或二磷酸腺苷(ADP)等经典的血小板激动剂引起的血小板活化会诱导NETs的生成。NETs除发挥抗菌活性外，还可以引发促凝、促血栓形成。NETs能够促进凝血酶的生成，反过来，激活的血小板促进NETs的形成[15]。NETs的DNA纤维网和NE可以激活凝血因子(Ⅻ和Ⅹa因子)，并结合血小板，导致血小板减少，最终导致DIC，因此，NETs与SAP严重程度之间的关系由DIC的发生率可以表明。NETs可能是导致SAP患者DIC发生的关键因素。

4.NETs与SAP的局限化——参与胰腺坏死组织屏障的形成相关:在早期急性炎症性损伤后，SAP患者的胰腺炎症不会停止在稳定阶段。相反，会引起局部并发症，例如胰腺坏死、胰腺假性囊肿的形成。NETs在坏死胰腺组织、胰腺假性囊肿中的存在，表明NETs参与了这些结构的形成。由于NETs促进渗出液中蛋白质的聚集，形成将炎性物质限制在一个部位的屏障，从而减少了对周围组织的损害。细胞外DNA和染色质相关蛋白有助于凝结并增强在NETs表面形成的纤维蛋白凝块。通过缓慢迁移和增殖成纤维细胞，该屏障最终可以转化为纤维化组织[16]。

四、NETs对SAP患者身体其他器官造成的损伤

SAP的特征是胰蛋白酶原异常激活后全身炎症的级联激活。故而中性粒细胞可能发生趋化性并迁移到身体各种组织以形成NETs。SAP的许多致命并发症，已显示与NETs的形成密切相关。因此，在SAP患者体内，NETs不仅存在于胰腺组织中并对其造成伤害，而且还会对其他相关器官造成更严重的损害。

1.肺部损伤：在SAP患者体内，NETs中的DNA纤维网在肺细小支气管中起支架作用，并与痰液结合形成痰液螺栓，由NE诱导的气道上皮产生过多的黏蛋白与痰液螺栓形成的复合物阻塞微小支气管，为细菌的生长和定殖创造了合适的环境，最终引起急性肺损伤。SAP会导致嗜中性粒细胞过度激活，过度活化的嗜中性粒细胞可能导致多器官功能不全综合征的发展，而肺部是该综合征的主要靶点。活化的中性粒细胞释放NE、ROS和其他促炎性介质，进一步激活NETs的形成，从而导致肺损伤[17]。MPO诱导肺泡上皮细胞中的DNA链断裂，从而破坏肺泡正常气体交换，引起急性肺损伤。

2.肾脏损伤：NETs的形成与DAMP相关，DAMP在多种疾病模型中引发炎性反应。此外，在人类和实验性胰腺炎中，多种DAMP被视为与胰腺炎相关的“危险信号”，例如高迁移率族1号盒(HMGB1)已显示对实验性SAP具有重要作用,并可能在SAP后参与肾脏损伤[18]。中和HMGB1可显著改善SAP病程及肾脏损伤。研究表明，NETs的形成受NF-κB通路的调节。在SAP小鼠体内，丁酸钠通过抑制NF-κB通路和调节HMGB1来减轻SAP小鼠的器官损伤[19]。Shi等[20]认为富含氢的盐水通过抑制活性氧(ROS)和NF-κB途径对牛磺胆酸钠诱导的SAP的肾脏损伤起到保护作用。

3.心脏损伤:当SAP中的胰蛋白酶进入心脏血液中，NETs可强化胰蛋白酶的活性，损伤心肌细胞。在SAP早期，调节NETs的 NF-κB过度活化，激活单核-吞噬细胞及中性粒细胞系统，释放大量炎性因子，导致冠状动脉内皮的损伤,SAP时活化的中性粒细胞释放微粒小泡，里面含有调节NETs形成的MPO,MPO可催化产生大量的ROS, 也可以破坏冠状动脉内皮细胞。经过NETs进一步激活的胰蛋白酶致使SAP患者血液处于高凝状态，将血小板活化，活化后的血小板与NETs结合凝集成血栓，堵塞血管[21]。研究表明，冠状动脉中与NETs相关的血栓经常引发心肌梗死，在SAP患者中已观察到[22]。在SAP患者体内，受损的血管内皮上浸润的T辅助细胞在NETs的作用下进一步激活，加重炎症浸润，增加了动脉粥样硬化斑块脱落的风险[23]。

4.肠黏膜屏障功能异常：肠屏障功能异常在SAP的病理生理中起着关键作用，受损的肠屏障可能成为其他并发症的源头，包括SIRS和MODS，这进一步加剧了SAP。越来越多的文献表明NF-κB和NLRP3促进炎性反应，而NF-κB/ NLRP3炎性体途径的激活是通过NETs介导的，进一步引发炎性细胞因子的释放[24]。Yang等[25]研究认为虫草素通过调节NF-κB和NLRP3炎性体的活化，抑制NTEs的活性，从而减缓SAP的症状，同时抑制促炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的产生。SAP可使肠黏膜通透性增加，坏死腺泡细胞释放的大量HMGB1可影响肠黏膜的物理屏障功能。研究表明，在SAP患者的肠道中，NETs破坏肠的微生态平衡，从而导致肠屏障受损，肠黏膜通透性增加，内毒素产生增加以及肠菌群失衡。

五、展 望

NETs自被发现以来就引起了科学界的极大兴趣，研究人员进行了大量研究以检查其结构、功能和形成机制。在确认这些结构具有强大的抗菌功能的同时，多项研究还发现NETs参与了多个器官中许多非感染性疾病的病理生理过程，例如急性炎症性疾病和血栓性疾病等。NETs及其成分在SAP引起的炎性应激下对正常组织的损害以及炎性细胞的激活引起炎性级联的过程中起着重要的作用。此外，NETs的形成是由胰液成分或SAP释放的炎性细胞因子引起的，它们可能通过胰腺腺泡损伤或胰管阻塞而诱SAP。因此，NETs和SAP的产生可能形成恶性循环。针对这一关系，对于NETs与SAP的功能、机制和关系以及针对NETs的干预措施吸引了众多研究人员的关注。今后新的检测技术和药物的开发将大大加速针对NETs的SAP患者的临床治疗。