超高压对西瓜汁香气相关酶的活性影响研究

包洪亮 ，马永杰，王瑞杰，胡慧杰，杜咏芳，胡雪静，高雪楠

（1.洛阳师范学院数学科学学院，河南洛阳 471934；2.洛阳师范学院食品与药品学院，河南洛阳 471934）

西瓜汁是很有潜力的果汁饮品，具有生津止咳、清热解暑、减轻浮肿、利尿等作用，深受人们的喜爱。但西瓜汁属于热敏性物料，在加工过程中容易出现不良气味、口感下降、营养损失等问题，从而影响产品质量。大量试验研究表明，果蔬香气物质由果蔬中各种关键酶作用于亚麻酸、亚油酸等香气前体物质而生成，尤其是果蔬汁在贮藏过程中，其风味的变化主要是由果蔬汁中的脂氧合酶、过氧化物酶及醇酰基转移酶等引起的[1-3]。作为非热加工技术，超高压处理在保证食品安全性的基础上，可使酶被激活或者钝化，不破坏食物的原始风味与营养物质，能在低温或室温条件下达到商业无菌，最大程度地保留食品原有的色、香、味，对保持食物品质起到很好的作用[4]。此外，超高压还具有施压过程均匀、灭菌均匀、安全系数高、耗能相对较少等优点[5]，适用于富含芳香物质的热敏性果蔬的加工与处理，并且原料的香味挥发及营养物质损失较少。目前，超高压技术在草莓、苹果、柿子、猕猴桃、芒果、杏汁及橙汁等食品加工方面都有一定的应用研究[5-8]，而在西瓜汁方面的研究较少。

研究表明，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）、氢过氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）和醇酰基转移酶（acyltransferase，AAT），普遍存在于高等植物中，在植物脂肪酸代谢过程中发挥着较大作用[9-12]。这些酶在西瓜冷藏过程中，如果被激活，会使一些风味物质如己醛、反-2-壬烯醛、顺-2-壬烯醇、6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮等的质量浓度降低，从而降低西瓜香气品质[3]。因此，要采取相应技术来控制这三种酶的活性，保留西瓜汁贮藏期内的香气成分。本文从改变西瓜汁的杀菌技术、避免高温处理过程入手，结合处理温度、时间、压力参数，旨在探求适宜的西瓜汁加工工艺，解决传统热处理带来的问题，使西瓜汁各指标达到市场标准并延长产品货架期，降低加工难度。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高压设备，BDS200FL，英国STANSTED 公司；紫外分光光度仪，UV-1800，日本岛津有限公司；气相色谱串联质谱，GC-MS-QP2010，日本岛津有限公司；离心机，Sigma-18K，Sartorius 仪器有限公司；单道移液枪，VP，德国Eppendorf 艾本德股份公司；手持式打浆机，HD2069/01，飞利浦电子有限公司。

冰醋酸、无水醋酸钠、十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、盐酸、硼酸、亚油酸（LA）、吐温20、氢氧化钠、ADH（醇脱氢酶）、Acetyl-CoA（乙酰辅酶A），均购于上海博湖生物有限公司；Tris 碱、MES-TRIS 缓冲液、40%乙醛、Triton-X100（聚乙二醇辛基苯基醚）、PVPP（交联聚乙烯吡咯烷酮）、氯化镁、丁醇、DTNB（二硝基苯甲酸），以上所用试剂全部为分析纯；实验用水为二次蒸馏水；顺-2-壬烯醇、壬醛、正己醛、反-2-壬烯醛、反,顺-2,6-壬二烯醇、邻苯二甲酸二乙酯、6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮、2-戊基呋喃、十一酸甲酯，分析纯，美国Sigma 公司；色谱级乙醇，含量95%，天津市彪仕奇有限公司。

选取新鲜成熟、无机械损伤的‘郑抗无籽1 号’无籽西瓜作为实验材料，购于洛阳盛德美超市。

1.2 试验方法

1.2.1 西瓜汁的制备

选取新鲜成熟、品质优良、无病虫害、无机械损伤的无籽西瓜，取中心部分瓜瓤榨汁。西瓜汁用单层滤布过滤，然后将过滤后的西瓜汁分装于铝箔纸制成的包装袋中，每袋装20～30 mL，用塑料薄膜封口机封口。

1.2.2 超高压处理及贮藏期试验

将密封好的西瓜汁置于超高压压力釜中，调整压力釜内水至合适的高度，温度为45 ℃，设定压力开始施压即可。

通过查阅文献[3]，根据消费习惯，对于鲜榨果汁，通常在7 d 之内被消费完，而通过600 MPa、60 min 超高压处理西瓜汁，其保质期远超过7 d。因此，结合实际生产，从节约能源和提高效率方面考虑，试验处理条件设定为200 MPa、20 min，400 MPa、10 min，400 MPa、20 min，400 MPa、30 min，600 MPa、20 min，对照组为用铝箔纸密封包装后未经高压处理的西瓜汁。将处理后的样品和对照组置于4 ℃冰箱内，贮藏0、1、2、3、5、10 d，随机抽取样品进行酶活及风味物质的测定。以原汁为对照，研究处理压力、处理时间及贮藏期对西瓜汁中LOX、HPL 及AAT 活性的影响。

1.3 酶活性的测定方法

1.3.1 LOX 活性测定

样品制备：取1.5 mL 西瓜汁和8 mL 磷酸缓冲液（pH=7.0）于离心管中，将离心管放入已预冷的离心机内，在4 ℃条件下，15 000 r/min 离心15 min，所得上清液即为粗酶液。

反应体系：采用3 mL 反应体系。取2.8 mL 磷酸缓冲液（pH=6.8）和100 μL、0.1 mol/L 反应底物液（亚油酸钠）于具塞试管中，混合摇匀后放入30 ℃水浴锅中保温10 min，之后再加入粗酶液100 μL；混匀后倒入比色皿内，反应开始15 s 时，在室温25 ℃下，波长234 nm 处测定吸光值，记录15 s 后的1 min 内吸光度OD 值的变化。

1.3.2 HPL 活性的测定

样品制备：取2 mL 西瓜汁和5 mL 磷酸缓冲液（pH=7.0）于离心管中，将离心管放入已预冷的离心机内，在4 ℃条件下，15 000 r/min 离心30 min，所得上清液即为粗酶液。

反应体系：采用3.5 mL 反应体系。取2 mL 醋酸缓冲液、0.75 mL 反应底物液、0.15 mL NADH、0.1 mL ADH 酶液和0.5 mL 粗酶液于具塞试管中，混合摇匀后倒入比色皿内，在室温下于波长340 nm 处测定吸光值，记录1 min内OD 值的变化。

1.3.3 AAT 活性的测定

样品制备：取2 mL 西瓜汁和5 mL 磷酸缓冲液（pH=7.0）于离心管中，将离心管放入已预冷的离心机内，在4 ℃条件下，15 000 r/min 离心30 min，所得上清液即为粗酶液。

反应体系：采用3 mL 反应体系。取2.5 mL MgCl2溶液、150 μL、乙酰-CoA（乙酰辅酶A）、50 μL 丁醇和150 μL 粗酶液于具塞试管中混合摇匀，添加100 μL 的DTNB，摇匀后倒入比色皿内，在室温下于波长412 nm 处测定吸光值，记录1 min 内OD 值的变化。

1.3.4 西瓜汁中典型风味物质含量的方法测定

采用气相色谱内标法，测定西瓜汁中的风味物质，内标物溶液的配制及风味物质的测定方法参照刘野等[3]的方法，稍有改动。每个样品取8 mL 西瓜汁，加入到体积为15 mL 的萃取瓶中。加入0.01%（体积分数）内标物溶液0.05mL，使内标物在西瓜汁样品的质量浓度为0.546mg/mL。

1.4 数据处理

三种酶残存活性的测定均进行3 次平行操作，取平均值。实验数据采取Excel 2010 软件统计，以Origin 9.0绘图。风味物质测定数据处理，采用SAS 8.12 及Ducan’s多重检验（P＜0.05），试验结果以均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 西瓜汁中LOX 活性的变化

超高压处理可使酶激活或钝化，影响香气合成途径中酶的作用，进而影响前体物质向香气化合物的转化[13-14]。一般情况下，采用较低压力时，如300 MPa 对PPO、POD 及LOX 等有激活作用，水果中某些香气成分会因这些酶的激活而受到损失，而400 MPa 处理时可使部分酶失活，使香气物质的降解减少[1]。经相同压力（400 MPa）不同保压时间（10、20、30 min）处理的西瓜汁中LOX 在4 ℃贮藏条件下，其酶活性的变化如图1 所示。相同保压时间（20 min）不同压力（200、400、600 MPa）处理的西瓜汁中LOX在4 ℃贮藏条件下，其酶活性的变化如图2 所示。

图1 相同压力（400 MPa）不同保压时间处理的西瓜汁在4 ℃贮藏期间LOX 活性的变化Fig.1 Changes of LOX activity in watermelon juice treated with the same pressure (400 MPa) at different holding time during storage at 4 ℃

图2 相同保压时间（20 min）不同压力处理的西瓜汁在4 ℃贮藏期间LOX 活性的变化Fig.2 Changes of LOX activity during storage of watermelon juice treated with different pressure at 4 ℃for the same holding time (20 min)

由图1、2 可见，贮藏期为0 d 时，经超高压处理后的LOX 活性均低于对照组。由图1 可知，相同压力下，保压时间越久，酶活性越低；在相同保压时间下，压力越大，对LOX 活性的钝化作用越强。随着贮藏天数的增加，对照组西瓜的LOX 活性有降低趋势，而经超高压处理后的LOX 活性则随贮藏天数的增加先上升后降低，基本在1～2 d 达到最大值。贮藏期为10 d 时，相同压力不同保压时间下，LOX 活性基本一致。另外，贮藏期为2 d 时，400 MPa、10 min 条件下的LOX 活性急速降低，可能是由试验中的误差所致。

由图2 可知，400 MPa、20 min 和600 MPa、20 min 这两组处理，LOX 活性均是在1～2 d 内显著上升，而在贮藏2 d 后，酶的活性均呈下降趋势，随后随贮藏天数的增加呈降低趋势。而在200 MPa、20 min 时，LOX 活性的趋势和对照组基本一致，说明200 MPa、20 min 的处理条件对LOX 活性基本无影响。

2.2 西瓜汁中HPL 活性的变化

经相同压力（400 MPa）不同保压时间（10、20、30 min）处理的西瓜汁中HPL 酶在4 ℃贮藏条件下，酶活性的变化如图3 所示。相同保压时间（20 min）不同压力（200、400、600 MPa）处理的西瓜汁中HPL 在4 ℃贮藏条件下，酶活性的变化如图4 所示。

图3 相同压力（400 MPa）不同保压时间处理的西瓜汁在4 ℃贮藏期间HPL 活性的变化Fig.3 Changes of HPL activity in watermelon juice treated with the same pressure (400 MPa) at different pressurekeeping time at 4 ℃during storage

图4 相同保压时间（20 min）不同压力处理的西瓜汁在4 ℃贮藏期间HPL 活性的变化Fig.4 Changes of HPL activity during storage of watermelon juice treated with different pressure at 4 ℃for the same holding time (20 min)

由图3、4 可知，贮藏第0 天时，经超高压处理后的HPL 活性均高于对照组。随着贮藏天数的增加，对照组西瓜汁的HPL 活性在0～2 d 时略微上升，随后呈降低趋势，而经超高压处理后的HPL 活性则随贮藏天数的增加逐渐上升，在1～2 d HPL 活性达到最大值，2 d 后，酶活性也随着贮藏天数的增加而逐渐降低。贮藏期为10 d时，相同的压力不同的保压时间下，保压时间越长酶活性越低。此外，贮藏期在1～2 d 时，200 MPa、20 min 处理的HPL 活性急速上升，且在2～3 d 内仍维持最大值，该值远超过其他组，这说明在200 MPa、20 min 处理条件下贮藏时间1～3 d 对HPL 有较强的激活作用。

2.3 西瓜汁中AAT 活性的变化

经相同压力（400 MPa）不同保压时间（10、20、30 min）处理的西瓜汁中AAT 在4 ℃贮藏条件下，其酶活性的变化如图5 所示。

图5 相同压力（400 MPa）不同保压时间处理的西瓜汁在4 ℃贮藏期间AAT 活性的变化Fig.5 Changes of AAT activity during storage of watermelon juice treated with the same pressure (400 MPa)at 4 ℃for different holding time

相同保压时间（20 min）不同压力（200、400、600 MPa）处理的西瓜汁中AAT 在4 ℃贮藏条件下，其酶活性的变化如图6 所示。

图6 相同保压时间（20 min）不同压力处理的西瓜汁在4 ℃贮藏期间AAT 活性的变化Fig.6 Changes of AAT activity during storage of watermelon juice treated with different pressure at 4 ℃for the same holding time (20 min)

由图5 和图6 可知，贮藏期为0 d 时，超高压处理后的AAT 活性均低于对照组，随着贮藏天数的增加，对照组和超高压处理的AAT 活性均逐渐上升，且在1～2 d达到最大值，2 d 之后，AAT 活性随着贮藏天数的增加呈递减趋势，10 d 以后AAT 基本无活性。

400 MPa、10 min 和200 MPa、20 min 两组的酶活性在1 d 时达到最大值，而400 MPa、20 min 和600 MPa、20 min 这两组的AAT 活性均是在2 d 时达到最大值，之后随贮藏天数的增加呈降低趋势，而400 MPa、30 min AAT活性的变化趋势和对照组基本一致，说明400 MPa、30 min 的处理条件对AAT 活性影响不明显，除此之外，贮藏2～3 d 时，200 MPa、20 min AAT 活性急速降低且低于对照组，可能是由误差所致。

通过以上分析可知，超高压处理西瓜汁的最佳参数条件是压力400 MPa，保压时间20 min，贮藏期1～10 d。在最佳参数条件下，三种酶的活性有一定程度的钝化，可以有效保证西瓜汁的风味品质。

2.4 超高压处理西瓜汁贮藏中典型风味物质的变化

由表1 可知，采用400 MPa、20 min 超高压处理西瓜汁，在4 ℃贮藏时，10 d 内各种风味物质含量变化不明显。综合分析，采用超高压处理西瓜汁，其风味物质的变化较小。贮藏期间能够很好地保证风味物质的品质。因此，超高压技术结合低温处理，可对西瓜汁贮藏与加工可以提供条件参考。

表1 400 MPa、20 min 超高压处理冷藏西瓜汁在4 ℃时典型风味物质质量浓度的变化Table 1 Change of typical flavor compounds content of high hydrostatic pressure treated watermelon juice during storage at 4 ℃for 400 MPa and 20 min

3 结论

本文采用超高压处理西瓜汁，以AAT、HPL 及LOX作为测定指标，研究了不同超高压条件对西瓜汁低温贮藏后香气相关酶活的影响及变化规律，从而确定了保持西瓜汁香气品质的最佳参数条件。结果表明：贮藏0 d时，超高压处理减弱了三种酶的活性，且相同的压力下，保压时间越久，残存酶活性越低。而经超高压处理后的三种酶活性随贮藏天数的增加先呈上升趋势，基本在1～2 d 达到最大值，2 d 之后，酶活性随贮藏天数的增加逐渐降低，10 d 后三种酶基本无活性。综合以上分析，根据实际生产过程，从节约能源和提高效率方面考虑，确定超高压处理西瓜汁的最佳参数条件是压力400 MPa，保压时间20 min，贮藏期1～10 d，此时西瓜汁的品质较佳。因此，超高压处理可以有效保证冷藏西瓜汁贮藏过程中的香气品质，为西瓜汁贮藏与加工技术提供理论依据。