改良法分离培养SD新生乳鼠原代心肌细胞*

孟香红， 曾 斌， 陈慧玲， 李伟东， 李 娜， 徐小勇

(1. 宁波卫生职业技术学院医学技术学院， 浙江 宁波 315104; 2. 宁波市医疗中心李惠利医院心血管科， 浙江 宁波 315040)

原代心肌细胞由于不受机体神经体液因素干扰，同时保持着众多在体心肌细胞的结构和功能特点，是心血管疾病临床和基础研究无可替代的体外实验模型。自20世纪60年代，Harary等[1]成功分离培养心肌细胞以来，关于原代心肌细胞纯化培养的方法不断改进和完善[2-4]，但仍旧存在操作繁琐、耗时较长、存活率不高、结构破坏等诸多缺陷[5]，且心肌细胞近乎是终末分化细胞无法传代培养，实验时必须每次从头分离纯化。因此，如何实现原代心肌细胞的简单快捷、高纯度、高活力分离培养，仍是心血管研究领域的亟待解决的瓶颈问题。本文利用Percoll梯度离心+5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)化学抑制法，将纯化的原代心肌细胞体外培养于含5%马血清的改良DMEM/F12中，在较短时间内成功获得了生长状态稳定、活力和纯度较高的原代新生大鼠心肌细胞，为心脏疾病机制研究和药物开发提供了理想的体外实验模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级新生SD 乳鼠(出生1～2 d)，雌雄不限，由罗格斯大学新泽西医学院实验动物中心提供。

1.2 主要实验试剂及设备

DMEM/F12或高糖DMEM培养基(Invitrogen)；丙酮酸钠(Thermo Fisher)； 维生素C(Gibco)；亚油酸(Sigma)；Ⅱ型胶原酶(Worthington Biochemical)；Percoll密度梯度离心液(GE Healthcare)；HEPES(Amresco)；马血清、胎牛血清(Gibco)；5-溴脱氧尿嘧啶、台盼蓝、0.1%Triton-X100、4% 多聚甲醛、PBS、DAPI(Sigma)；青链霉素、cTNT 鼠单克隆抗体(Invitrogen)；Alexa Fluor 568驴抗鼠荧光二抗(Thermo Fisher)；荧光相差显微镜(Olympus)；二氧化碳细胞培养箱(Thermo Fisher)；倒置光学显微镜(Leica)。……