石蒜碱抑制胃癌细胞系MGC-803增殖、迁移和侵袭

鲍美美，徐 雯，王 超，王 佳，苗小芬*

(1.苏州大学 物理科学与技术学院，江苏 苏州 215006；2.南京中医药大学附属苏州市中医医院 病理科，江苏 苏州 215009)

胃癌(gastric cancer)是全世界第五大恶性肿瘤，起源于胃黏膜上皮，全世界每年约有100万人死于该病，这导致了巨大的生态和公共健康负担[1]。近年来，随着新的诊断和治疗策略的发展，胃癌的发病率和病死率正稳步下降。然而，由于肿瘤的转移和复发，胃癌患者的总体5年生存率仍然低于29%[2]。

盐酸石蒜碱(lycorine hydrochloride，LH)是石蒜科植物中广泛存在的一种具有药理活性的生物碱。越来越多的证据表明植物来源的LH具有多种药理作用，如抗病毒、抗菌、抗寄生虫、抗感染和抗肿瘤作用[3]。LH多种功能的分子机制包括诱导细胞凋亡，抑制细胞周期进展和自噬等[4]。目前已有证据表明LH对正常细胞的毒性很低，并且对肿瘤细胞的治疗作用强于正常细胞[5]，然而关于LH在胃癌中的应用鲜有报道。

microRNA(miRNA)是一类内源性、单链、小的非编码RNA，长度约为22个核苷酸，在进化中高度保守，能够在3′端非翻译区与靶信使RNA(mRNA)结合，调节目的基因的表达[6]。miR-203是一种皮肤特异性miRNA，除参与表皮构成外，亦可作为肿瘤抑制因子或致癌基因参与多种肿瘤的增殖和转移[7]。研究显示miR-203在结直肠癌中低表达并且抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖[8]。miR-203可通过靶向毛细血管扩张突变激酶ATM抑制胃癌细胞的侵袭和转移[9]。大量证据表明，miR-203通过靶向Slug调节癌的起始和发展。

本研究探讨LH对人胃癌细胞MGC-803细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并分析其作用机制，为其作为抗癌药物的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人胃癌细胞系MGC-803为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂：盐酸石蒜碱(成都曼思特生物科技有限公司)；DMEM培养基(HyClone公司)；胎牛血清(CLARK公司)；瑞氏-姬姆萨染液(南京建成科技有限公司)；MTT染液、Trizol(上海碧云天生物技术有限公司)；RNA酶、PI染液(Sigma Aldrich公司)；RT-qPCR试剂(Vazyme公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养：用含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM完全培养液，在37 ℃、5% CO2条件下培养MGC-803细胞，每2～3 d按1∶3的比例传代1次。

1.2.2 MTT法检测细胞活性：取对数增殖期的人胃癌细胞MGC-803，以每孔3×103个细胞接种于96孔板中，培养24 h后加入含不同浓度LH的培养基，对照组含细胞和培养基，空白组含培养基，每组设置6个复孔，放入37 ℃、5% CO2培养箱继续培养。分别于24及48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h，每孔加入150 μL DMSO溶液于摇床避光低速振荡10 min，待结晶全部溶解后在酶标仪上测定490 nm处的吸光度，实验独立重复3次。细胞增殖抑制率/%=[1-(A给药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)]×100%

1.2.3 集落形成实验检测细胞的增殖能力：将不同浓度的LH作用胃癌MGC-803细胞48 h，消化后以1×103个/孔接种于6孔板内，十字法使其均匀分布，待细胞贴壁3 d后换成新鲜的DMEM培养基继续培养7 d，每3天更换1次培养基。当培养基中出现肉眼可见克隆且显微镜下单个集落细胞计数大于50时，终止培养，弃去培养液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定细胞10 min，用瑞氏-姬姆萨染液进行染色，去离子水洗净风干后倒置显微镜拍照观察计数，实验独立重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期：用不同浓度的LH处理胃癌MGC-803细胞48 h后，收集细胞，PBS洗涤2次，再用70%冰乙醇于4 ℃进行固定过夜。离心洗涤后，用预冷的PBS进行重悬，加入5 μL 10 mg/mL RNase A，37 ℃避光处理30 min，再用50 μg/mL的PI于4 ℃避光处理30 min，最后利用流式细胞仪检测细胞周期分布，实验独立重复3次。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移：取对数增殖期的胃癌MGC-803细胞接种于6孔板中，待细胞汇合达到80%左右时，用黄色枪尖在每个孔内竖直划痕，PBS清洗3遍后加入含不同浓度LH的低血清DMEM培养基继续培养，于0、24 及48 h分别用瑞氏-姬姆萨染液进行染色拍照，记录各组细胞划痕宽度，实验独立重复3次。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞侵袭：将无血清DMEM培养基和Matrigel基质胶以1∶7比例稀释后置于冰上，取25 μL加入Transwell上室膜上铺平，37 ℃培养箱静置30 min待其凝固，使用前先用无血清培养基浸润上室膜。将LH作用48 h后的胃癌MGC-803细胞消化离心，用无血清培养基重悬并计数，在上室中分别加入1×105个细胞，下室加入DMEM完全培养基。孵育24 h后，用棉签擦去膜上层未迁移的细胞，取出膜后用PBS洗3次，瑞氏-姬姆萨染液染色，风干后用中性树脂封片显微镜拍照，实验独立重复3次。

1.2.7 RT-qPCR检测相关基因的表达：收集LH作用48 h的胃癌MGC-803细胞样品，用Trizol 冰上裂解10 min，利用氯仿提取RNA并溶解在DEPC水中。使用反转录试剂盒对RNA样品进行反转录测定以合成cDNA。用SYBR实时PCR试剂盒进行RT-qPCR实验。所有引物均获自Genewiz公司，使用2-ΔΔCt法分析mRNA表达。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Fig 1 PCR primer sequence

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 LH对MGC-803胃癌细胞活性的影响

与对照组相比，LH对MGC-803细胞增殖的抑制率随着浓度增加呈递增趋势(P<0.05或P<0.01)，另外随着作用时间的延长，抑制作用也显著增强(图1)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group图1 MTT法检测MGC-803 细胞活性的变化Fig 1 MTT assay for the changes of MGC-803 cell activity

2.2 LH对MGC-803胃癌细胞集落形成能力的影响

与对照组相比，LH作用后细胞形成的集落数量明显减少，体积也随之减小(P<0.01)，且呈浓度依赖性，当LH浓度达到20 μmol/L时几乎没有单克隆形成(表2)。

表2 各组MGC-803细胞克隆形成数目的比较Table 2 Comparison of the number of colony formation of MGC-803 cells in each n=3)

2.3 LH对胃癌MGC-803细胞周期的影响

随着LH浓度的增加，G0/G1期细胞所占百分率逐渐降低，S期细胞所占百分率逐渐升高，而G2期分布比例变化不大(图2，表3)。

表3 各组细胞周期分布的比较Table 3 Comparison of cell cycle distribution in each n=3)

图2 流式细胞测量术检测各组MGC-803细胞周期分布情况Fig 2 Flow cytometry assay for cell cycle distribution of MGC-803 cells

2.4 LH抑制胃癌MGC-803细胞的迁移

划痕24 h后对照组已有部分细胞向划痕处迁移，迁移比例为(60.37±1.40)%，48 h后细胞在划痕处的迁移面积逐渐增大，迁移比例为87.17%±0.55%，划痕伤口宽带缩小；相比之下0.625 μmol/L组及2.5 μmol/L组细胞的迁移面积明显小于对照组，24 h的迁移比例分别为39.70%±0.75%、35.80%±0.50%，迁移受到抑制，且48 h的抑制作用更为明显，迁移比例分别为55.67%±0.65%、40.80%±1.40%(P<0.01)(图3)。

图3 划痕实验检测各组MGC-803细胞迁移情况Fig 3 Wound healing assay for migration of MGC-803 cells

2.5 LH抑制人胃癌MGC-803细胞的侵袭

与对照组相比，给药组穿膜细胞数明显减少，当LH的浓度为1.25 μmol/L时细胞侵袭率为40%，而LH的浓度为2.5 μmol/L时细胞侵袭率仅为20%(P<0.01)(图4)。

图4 Transwell实验检测各组MGC-803细胞侵袭情况Fig 4 Transwell assay for invasion of MGC-803 cells

2.6 LH对人胃癌MGC-803细胞内miR-203、Slug、MMP2和MMP9基因表达的影响

随着LH浓度的升高，MGC-803细胞内N-cadherin、vimentin、Zeb1和Snail的表达水平没有明显变化。Slug、MMP2和MMP9的表达水平显著降低，而miR-203的表达水平显著升高，其中5 μmol/L组的miR-203表达水平显著高于对照组、1.25 μmol/L和2.5 μmol/L组，而Slug、MMP2和MMP9表达水平显著低于对照组、1.25 μmol/L和2.5 μmol/L组(P<0.01)(表4～6)。

表4 各组MGC-803细胞内N-cadherin、vimentin、Zeb1基因表达水平的比较Table 4 Comparison of N-cadherin,vimentin,Zeb1 gene expression levels in each group of MGC-803

表5 各组MGC-803细胞内Snai1、MMP2、MMP9基因表达水平的比较Table 5 Comparison of Snai1,MMP2,MMP9 gene expression levels in each group of MGC-803

表6 各组MGC-803细胞内Slug、miR-203基因表达水平的比较Table 6 Comparison of Slug,miR-203 gene expression levels in each group of MGC-803 cells

3 讨论

miRNAs作为重要的转录后调控因子，已被广泛报道参与多种生理和病理过程[10]。已有的研究证据表明，多种miRNAs在胃癌进展过程中异常表达，并介导多种靶基因调控细胞增殖、侵袭、转移等。利用RT-qPCR检测了多例胃癌样本及配对的非癌样本中miR-203的表达情况，结果显示胃癌样本中miR-203的表达显著低于非癌样本，且与胃癌晚期及淋巴结转移密切相关，提示miR-203的下调可能在胃癌的发展过程中起关键作用[11]。过表达miR-203显著抑制胃癌细胞集落形成、细胞迁移及侵袭。本研究显示LH能显著升高MGC-803细胞内miR-203的表达水平，从而抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

转移是导致胃癌死亡率较高的主要原因。上皮细胞间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是与转移进程有关的复杂生理过程，可使细胞间黏附丧失，细胞角蛋白结构发生改变，提高癌细胞的迁移和侵袭能力[12]。多种研究表明miRNAs参与该过程[13]。本研究将LH作用于胃癌细胞后，miR-203的表达显著上升，而Slug的表达显著降低，提示miR-203可能与Slug协同作用抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，可能是LH发挥抗胃癌的靶标分子。

基质金属蛋白酶MMPs是选择性调控肿瘤微环境促进肿瘤转移的重要因子，被认为是EMT过程中的诱导剂。在大部分肿瘤类型中，MMPs的表达水平都显著升高，其中MMP2和MMP9是主要的蛋白水解酶，通过破坏基底膜，促进肿瘤细胞局部和远处的浸润，诱发肿瘤细胞的侵袭转移。有研究表明MMP2和MMP9的血清学水平与胃癌组织的侵袭深度、癌细胞的转移呈正相关[14]。本研究显示LH作用后MGC-803细胞内MMP2和MMP9的表达水平下降，可能是由于抑制了细胞迁移和侵袭能力。

综上所述，LH抑制MGC-803细胞增殖、迁移和侵袭，可能与上调miR-203的表达，下调Slug、MMP2及MMP9的表达相关。该研究表明低毒高效的LH对转移性胃瘤的治疗具有潜在的应用前景。