菠萝SVP基因对乙烯利刺激的响应

李玉静，陈哲，胡福初，阮城城，罗志文，王祥和，范鸿雁，张治礼

摘  要：SVP（short vegetative phase）是一类开花抑制基因，通过调节开花相关基因的表达，影响植物从营养生长阶段向生殖生长阶段的转变进程。根据公布的菠萝基因组信息，从‘台农4号菠萝中克隆到2个AcSVP基因AcSVP1和AcSVP2。结果表明：AcSVP1和AcSVP2分别编码225和230个氨基酸，均含有MADS-box、K-box保守结构域，二者所编码蛋白均属MADS-box基因家族成员。定量PCR分析结果显示，2个AcSVP基因在菠蘿茎尖、茎基和叶中均有不同程度的表达，乙烯利处理后主要表现为下调。乙烯利处理8 h内，AcSVP1在茎尖、叶中的表达显著下调，但在茎基组织中呈现先下调后上升的趋势;乙烯利处理后8 h，茎基组织中AcSVP1的相对表达量略高于对照。与AcSVP1不同，乙烯利处理8 h内AcSVP2在茎尖、茎基、叶3种组织中均明显下调;乙烯利处理后8 h，AcSVP2在茎尖、茎基、叶组织中的相对表达量只有对照的8%、44%和33%。SVP是目前已知的最重要的一类开花抑制基因，AcSVP在响应乙烯利的过程中表达显著下调，表明其在乙烯利诱导菠萝成花过程中可能发挥重要作用。

关键词：菠萝;SVP基因;基因克隆;乙烯利

中图分类号：S668.3      文献标识码：A

Responses of Pineapple SVP Genes to Ethephon Stimulation

LI Yujing1，2， CHEN Zhe2*， HU Fuchu2， RUAN Chengcheng1，2， LUO Zhiwen2， WANG Xianghe2，

FAN Hongyan2， ZHANG Zhili2*

1. Institute of Life Sciences and Pharmacy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Tropical Fruit Trees， Hainan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Tree Biology of Hainan Province / Haikou Investigation Station of Tropical Fruit Trees， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571100， China

Abstract： SVP （short vegetative phase） is a type of flowering suppressor gene， which regulates the expression of flowering-related genes to affect the transition process of plants from the vegetative growth stage to the reproductive growth stage. According to the published pineapple genome information， two AcSVP genes named AcSVP1 and AcSVP2 were cloned in ‘Tainong 4 pineapple. Analyses showed that AcSVP1 and AcSVP2 encoded 225 and 230 amino acids， respectively， and both contained MADS-box and K-box conserved domains. The proteins encoded belonged to the MADS-box gene family members. qRT-PCR analysis showed that the genes were expressed in different degrees in stem tip， stem base and leaf tissues， and after ethephon treatment the genes were mainly down-regulated to varying degrees compared with the control. Within 8 h of ethephon treatment， AcSVP1 was significantly down-regulated in the stem tips and leaves while in the stem-basal tissue which showed a trend of first down and then up-regulation， and the relative expression of AcSVP1 in the stem-basal tissues was slightly higher than that of its control after 8 h of ethephon treatment. Different from AcSVP1， AcSVP2 gene was significantly down-regulated in stem tip， stem base and leaf tissues within 8 h of ethephon treatment， and the relative expression level of AcSVP2 in the stem tip， stem base and leaf tissues was respectively about 8%， 44% and 33% of the control after 8 h of ethylene treatment. SVP was the most important type of flowering suppressor gene. And the down-regulated of AcSVP in response to ethephon stimulation indicated that AcSVP maybe play a key role in the flowering processes of pineapple in responses to ethephon signal.

Keywords： Ananas comosus; SVP gene; gene cloning; ethephon

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.008

开花是有性生殖植物繁衍的一种重要方式。植物开花过程是营养生长向生殖生长的转变，其以花芽分化为特征[1];菠萝花芽分化的过程可以划分为成花诱导期、成花启动期和花器官发育期3个时期。成花诱导是高等植物由营养生长向生殖生长过渡的重要步骤[2]。近年来，人们通过对拟南芥、水稻等模式植物开花调控的研究，将高等植物成花调控归纳为光周期途径、自主途径、发育年龄控制途径、赤霉素途径、春化途径和环境温度途径等六大途径[3]。它们既可以单独调节植株开花过程，也可以彼此影响共同组成一个复杂的开花调控网络。

菠萝（Ananas comosus L.）又称凤梨，是一种原生长于美洲的热带草本果树，广泛分布在全球各地。菠萝是我国主要的经济作物之一，2018年我国菠萝种植面积超过8万hm2，总产量超过200万t（FAOSTAT数据），主要分布在广东、广西、云南、福建、海南、台湾等地[4]。成花率不高和开花时间不一致是菠萝自然成花过程中经常发生的问题，生产实践中常常通过施用乙烯利或乙炔诱导菠萝成花[5]。虽然乙炔或乙烯在实际生产中能够促进凤梨科植物成花，但也存在温度、湿度、阴雨天气、菠萝长势等影响催花效果甚至导致催化失败等问题。由于乙炔或乙烯利诱导菠萝成花的机制目前并不清楚，生产上改善催花效果往往只能凭种植户经验而非理论的指导。因此，开展乙炔或乙烯利诱导菠萝成花机制的研究具有重要的理論价值和实践意义。

SVP（short vegetative phase）是一类开花抑制基因。SVP蛋白是通过与FT（FLOWERING LOCUS T）和SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREX PRESSION OF CONSTANS 1）的启动子结合阻碍其转录表达延迟植物成花[6]。借助菠萝基因组数据库信息，本研究以‘台农4号菠萝为材料成功克隆到SVP的2个同源基因AcSVP1和AcSVP2，利用生物信息学和分子生物学技术对其进行了研究，研究结果将为深入阐释SVP基因在乙烯利诱导菠萝成花中的功能定位提供数据支持。

1  材料与方法

1.1  材料

以种植于海南省美亭村菠萝基地、生长时间300 d左右（约25片叶）的‘台农4号菠萝为材料，40%乙烯利（1600 mg/L）300倍液灌心处理后[7]2 h、4 h、6 h、8 h、1 d、2 d，分别取茎尖、茎基（剥皮后的茎中部组织）、成熟功能叶，液氮速冻后于–80 ℃保存。以同等体积的清水处理作为对照并取样。

1.2  AcSVP基因克隆

从Pineapple Genomics Database（http：// pineapple.angiosperms.org/pineapple/html/index. html）中下载菠萝基因组所有蛋白序列，从NCBI下载不同物种SVP蛋白序列，通过本地Blast（e<0.01）搜索，将菠萝基因组中疑似SVP蛋白进行Blast p，所有序列均通过CD-search（https：// www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）检索以确定其含有MADS-box和K-box结构域，发现菠萝基因组中存在3条SVP序列。

采用华越洋植物RNA提取试剂盒提取菠萝叶片组织总RNA，使用TaKaRa生物公司反转录试剂盒获得cDNA。根据预测的3条SVP基因序列设计相应引物（表1），扩增菠萝SVP基因的CDS区。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min;后95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32个循环;最后72 ℃再延伸5 min。对扩增产物进行凝胶检测并分析结果。由天一辉远生物试剂公司开展引物合成和测序工作。

1.3  AcSVP蛋白序列结构分析

借助NCBI提供的BLAST（https：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线工具对测序结果进行搜索分析，ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder/）分析AcSVP基因编码区;利用ProtParam（http：//web.expasy. org/protparam/）对成功克隆到的2个AcSVP蛋白的基本理化性质进行预测，用GOV IV（http：//npsa-prabi.ibcp.fr）分析蛋白二级结构，Blast p在线检索菠萝2个SVP蛋白的其他物种来源的同源蛋白序列，借助DNAMAN 6.06和MEGA 6.0工具分别完成不同来源SVP蛋白的同源比对分析工作和构建系统发育树。

1.4  荧光定量PCR

以‘台农4号菠萝茎尖、茎基或叶片组织总RNA逆转录得到的cDNA作为PCR模板，引物见表1，EF1为内参基因[8]，每个处理重复3次。采用10 μL反应体系：1 μL cDNA，5 μL SYBR Green I Master，10 μmol/L的正反向引物各0.5 μL，3 μL ddH2O。用2-ΔΔCT法[9]对2个AcSVP基因进行相对定量分析，利用Excel、SPSS相关软件进行数据分析。

2  结果与分析

2.1  菠萝SVP基因家族基因的挖掘与结构分析

利用生物信息学技术，通过对菠萝基因组数据库的分析，发现3条SVP序列，分别命名为AcSVP1、AcSVP2和AcSVP3。DNAMAN 6.06分析研究结果显示，预测中的AcSVP1和AcSVP2开放阅读框碱基相似度高达72.58%，大约有

190 bp核苷酸的差异，涉及82个氨基酸的差异;AcSVP1和AcSVP3相似度高达72.58%，有188 bp核苷酸差异，涉及83个氨基酸的差异;AcSVP2和AcSVP3相似度高达99.71%，有2 bp核苷酸的差异，涉及1个氨基酸的差异。GSDS（http：//gsds. gao-lab.org/index.php）分析表明（图1），AcSVP1含有9个外显子，8个内含子;AcSVP2和AcSVP3均含有8个外显子和8个内含子。

2.2  菠萝AcSVP基因编码区克隆与序列分析

根据公布的菠萝基因组数据库信息设计引物，以菠萝叶片总RNA反转录的cDNA为模板，从‘台农4号菠萝基因组中成功克隆到AcSVP1和AcSVP2。序列分析结果表明，‘台农4号AcSVP1和AcSVP2与公布的菠萝基因组相应基因的cDNA ORF序列完全一致，分别为678 bp和693 bp，分别编码225和230个氨基酸。

GOR IV预测发现，AcSVP1与AcSVP2均含有无规则卷曲、α-螺旋和延伸链等结构（图2）。三类结构在AcSVP1蛋白中所占比例分别为27.56%、56.89%、15.56%;在AcSVP2蛋白中所占比例分别为29.13%、59.13%、11.74%。

豎线从长到短依次为α-螺旋、折叠延伸链和无规则卷曲。

The vertical line from length to short is alpha helix， folding

extension chain and irregular curl.

Protparam在线预测2个AcSVP蛋白的理化特性结果表明，AcSVP1蛋白理论等电点（pI）为6.33、蛋白的不稳定参数为51.27，脂溶指数为88;AcSVP2蛋白理论pI为8.44，蛋白的不稳定参数为47.67，脂溶指数为89.52，表明AcSVP1、AcSVP2蛋白可能都是亲脂性蛋白。

2.3  菠萝AcSVP蛋白同源性分析

将AcSVP1和AcSVP2的蛋白序列与其他21个物种SVP类基因编码的蛋白质进行序列比对（图3），发现二者都属于典型的Type Ⅱ型MADS-box蛋白。Blast p比对发现，菠萝AcSVP1蛋白序列与油棕（Elaeis guineensis）SVP相似度较高，为73.68%;AcSVP2与油棕的STMADS11-1的相似度较高，为72.44%。菠萝AcSVP1与AcSVP2相似度为72.58%，有82个氨基酸的差异。

借助MEGA 6.0构建了2个AcSVP蛋白与其他21个物种的SVP同源蛋白系统发育树。分析表明（图4），AcSVP1与油棕的SVP遗传距离较近;AcSVP2与油棕的STMADS11-1遗传距离较近。

EgSVP： Elaeis guineensis， XP_010942683.1; CsSVP： Crocus sativus， QIH12017.1; DcSVP： Dendrobium catenatum， XP_020692709.1; ZmSVP： Zea mays， NP_001105154.2; EgSTMADS11-1： Elaeis guineensis， AAW66885.1; HbSVP： Hevea brasiliensis， XP_021662492.1; VvSVP： Vitis vinifera， XP_019073897.1; VrSVP： Vitis riparia， XP_034692566.1; MeSVP： Manihot esculenta， XP_021631111.1; CaSVP： Coffea arabica， XP_027075278.1; AtSVP： Arabidopsis thaliana， NM_001335800.1; BjSVP1： Brassica juncea， JQ906715.1; MaSVP： Morus alba var. alba， AYK27570.1; BjSVP2： Brassica juncea， AFM77906.1; BnSVP： Brassica napus， AFM77910.1; LdSVP： Lansium domesticum， AST22412.1; CtSVP： Citrus trifoliate， ACJ09170.1; SiSVP： Sesamum indicum， XP_020554864.1; GmSVP： Glycine max， XP_006574410.1; SlSVP： Solanum lycopersicum， XP_004237993.1; PsSVP： Paeonia suffruticosa， AHJ60267.1.

HbSVP： Hevea brasiliensis， XP_021662492.1; MeSVP： Manihot esculenta， XP_021631111.1; SiSVP： Sesamum indicum， XP_020554864.1; VvSVP： Vitis vinifera， XP_019073897.1; VrSVP： Vitis riparia， XP_034692566.1; CaSVP： Coffea arabica， XP_027075278.1; GmSVP： Glycine max， XP_006574410.1; LdSVP： Lansium domesticum， AST22412.1; CtSVP： Citrus trifoliate， ACJ09170.1; PsSVP： Paeonia suffruticosa， AHJ60267.1; BjSVP2： Brassica juncea， AFM77906.1; ; AtSVP： Arabidopsis thaliana， NM_001335800.1; BjSVP1： Brassica juncea， JQ906715.1; BnSVP： Brassica napus， AFM77910.1; EgSTMADS11-1： Elaeis guineensis， AAW66885.1; CsSVP： Crocus sativus， QIH12017.1; DcSVP： Dendrobium catenatum， XP_020692709.1; ZmSVP： Zea mays， NP_001105154.2; EgSVP： Elaeis guineensis， XP_010942683.1; SlSVP： Solanum lycopersicum， XP_004237993.1;.MaSVP： Morus alba var. alba， AYK27570.1.

2.4  菠萝AcSVP基因表达对乙烯利刺激的响应

乙烯利处理后，AcSVP1和AcSVP2基因对乙烯的响应总体表現为下调，但不同组织、不同处理时间表达量略有差异;乙烯利处理后2 d，2个基因的表达都表现为下调，但下调幅度不同，其中AcSVP2基因在3种组织中下调的更为明显（图5A～图5F）。乙烯利处理的8 h内，AcSVP1在茎尖、叶组织中的表达下调明显，但在茎基组织中呈现出先下调后上升的趋势。乙烯利处理后4 h，AcSVP1在茎尖部位的表达量处于最小值，约为对照的37%。施用乙烯利后6 h，茎基组织中表达量达最小值，约为对照的7%;乙烯利处理后8 h，AcSVP1的相对表达量略高于对照。施用乙烯利8 h，叶中表达量达最小值，约为对照的8%（图5A～图5C）。AcSVP2的表现与AcSVP1略为不同。乙烯利处理的8 h内，AcSVP2在茎尖、茎基、叶3种组织中均明显表现为下调。乙烯利处理后8 h，AcSVP2在茎尖、茎基、叶组织中的相对表达量只有对照的8%、44%和33%（图5D～图5F）。

AcSVP1和AcSVP2基因在茎尖、茎基和叶组织中均有不同程度的表达，乙烯利处理后，AcSVP1、AcSVP2均在茎尖组织中相对表达量处于最小值;而未处理时，AcSVP1和AcSVP2在茎基组织中相对表达量处于最小值（图5G～图5H）。

3  讨论

MADS-box基因家族有11个亚族，SVP作为MADS-box基因家族第11个亚族——STMADS11亚族的成员，主要是作为成花负调节因子参与植物的花发育和开花进程的调控[3， 10-12]。目前已经克隆到多种植物的SVP同源基因，如甘薯[13]、番茄[14]、猕猴桃[15]等。根据生物信息学分析结果，我们在公布的菠萝基因组数据库中找到了3条AcSVP，分别命名为AcSVP1、AcSVP2和AcSVP3。本研究成功克隆到‘台农4号菠萝AcSVP1和AcSVP2基因，编码蛋白都含有MADS-box结构域和K-box结构域，均属于MADS-box基因家族的STMADS11亚族。生物信息学分析显示，预测中的AcSVP2和AcSVP3虽然位于不同的染色体上，但cDNA序列长度一致，只有中间位置有2 bp的核苷酸差异，利用同一对引物同时克隆AcSVP2、AcSVP3，未能克隆到AcSVP3基因，可能是由于‘台农4号菠萝基因组与公布的数据库（来自F153菠萝品种和MD2菠萝品种）[16]存在差异有关，也有可能这2个预测的基因是同一个基因。

包含SVP基因的STMADS11亚族基因被认为在植物营养生长以及营养生长向生殖生长转变过程中发挥关键性作用[17]。拟南芥SVP突变体表现为严重的早期开花表型，AtSVP过量表达可以使拟南芥开花时间推迟[6， 18]。桂花花芽分化需要一定时间的低温环境。低温处理后3个桂花OfSVP基因的表达均显著下调，同时位于下游的OfSOC1和OfFT的表达量却明显升高[19]。SVP1基因在成花诱导期可以响应乙烯，并且相比对照明显呈现下调表达，但与成花启动期对照相比表达无明显差异;而SVP2基因在成花诱导期和成花启动期的表达相比对照均呈现明显下调表达，鉴于成花诱导是开花的第一步，SVP1与SVP2 2个基因的表达在成花诱导期和成花启动期的表达与对照相比差异逐渐减弱，因此并没有对花器官发

SA：茎尖;SB：茎基;L：叶;不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

SA： Stem apex; SB： Stem base; L： Leaf; Different lowercase letters in the figure show significant difference at 0.05 level.

育期进行表达分析，如有需要，在以后的实验中将会对这2个SVP基因在花器官发育时期的表达情况进行分析。已有越来越多的证据证实，SVP抑制植物成花可能是通过抑制下游基因SOC1和FT的表达参与植物开花进程调控。低温和乙烯利处理都可以诱导菠萝成花，即低温和乙烯可以加速菠萝营养生长向生殖生长的转变。乙烯利明显下调‘台农4号菠萝AcSVP1和AcSVP2基因在茎尖和叶组织中的表达，表明AcSVP1和AcSVP2基因可能参与了乙烯利诱导菠萝营养生长向生殖生长的转变过程。

已有研究表明，乙烯通过加速DELLE蛋白的富集影响赤霉素途径从而达到延缓成花的目的，AtSVP可以通过抑制赤霉素合成酶基因GA20ox2的表达降低赤霉素含量进而延迟拟南芥成花[20-21]。乙烯处理能够延迟拟南芥开花、刺激菠萝成花，表明乙烯对不同植物开花的调节不同，乙烯促进菠萝成花是单独作用还是与其他开花途径共同作用值得关注[22-23]。

参考文献

[1] 宋  峥. 油菜花芽分化调节机理研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2009.

[2] 宋  杨， 窦连登， 张红军. 高等植物成花诱导调控的分子和遗传机制[J]. 植物生理学报， 2014， 50（10）： 1459-1468.

[3] 高耀辉， 马  斌， 魏光普， 等. 菊花SVP和AGL24基因的克隆及序列分析[J]. 分子植物育种， 2021， 19（13）： 4286-4292.

[4] 杨  眉， 迟晓君. 我国菠萝皮渣综合利用的研究进展[J]. 中国果菜， 2019， 39（8）： 48-51.

[5] Chandra Das S， Prakash J， Suresh C P， et al. Pineapple cultivation in hilly Tripura with year around production： improving livelihood opportunities in rural areas of Tripura[J]. Acta Horticulturae， 2011（902）： 291-298.

[6] Li D， Liu C， Shen L S， et al. A repressor complex governs the integration of flowering signals in Arabidopsis[J]. Developmental Cell， 2008， 15（1）： 110-120.

[7] 华  敏， 王祥和， 何  凡， 等. 台农16号菠萝催花试验[J]. 中国南方果树， 2009， 38（4）： 49-51.

[8] 李瑞雪， 余三淼， 李  夏， 等. 红苞凤梨实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选[J]. 热带亚热带植物学报， 2017， 25（3）： 250-256.

[9] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCT method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[10] Brill E M， Watson J M. Ectopic expression of a Eucalyptus grandis SVP orthologue alters the flowering time of Arabidopsis thaliana[J]. 2004， 31（3）： 217.

[11] Lee J H， Park S H， Lee J S， et al. A conserved role of SHORT VEGETATIVE PHASE （SVP） in controlling flowering time of Brassica plants[J]. 2007， 1769（7/8）： 455-461.

[12] Jaudal M， Monash J， Zhang L， et al. Overexpression of Medicago SVP genes causes floral defects and delayed flowering in Arabidopsis but only affects floral development in Medicago[J]. Journal of Experimental Botany， 2014， 65（2）： 429-442.

[13] Kim S H， Mizuno K， Fujimura T. Isolation of MADS-box genes from sweet potato [Ipomoea batatas （L.）Lam.] expressed specifically in vegetative tissues[J]. Plant and Cell Physiology， 2002， 43（3）： 314-322.

[14] Mao L， Begum D， Chuang H W， et al. JOINTLESS is a MADS-box gene controlling tomato flower abscission zone development[J]. Nature， 2000， 406（6798）： 910-913.

[15] Wu R M， Walton E F， Richardson A C， et al. Conservation and divergence of four kiwifruit SVP-like MADS-box genes suggest distinct roles in kiwifruit bud dormancy and flowering[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（2）： 797-807.

[16] 徐慧敏. 甘蔗現代栽培杂种及其两个祖先种全长转录组比较研究和菠萝基因组数据库[D]. 福州： 福建农林大学， 2019.

[17] 李玉舒， 杨炜茹， 程堂仁， 等. 梅花2个SVP基因的克隆与表达分析[J]. 西北植物学报， 2019， 39（7）： 1163-1171.

[18] Hartmann U， Hohmann S， Nettesheim K， et al. Molecular cloning of SVP： a negative regulator of the floral transition in Arabidopsis[J]. The Plant Journal， 2000， 21（4）： 351-360.

[19] 朱益民， 王千千， 董  彬， 等. 桂花OfSVP响应环境低温对花芽分化的影响[J]. 园艺学报， 2019， 46（6）： 1134-1144.

[20] Achard P， Baghour M， Chapple A， et al. The plant stress hormone ethylene controls floral transition via DELLA- dependent regulation of floral meristem-identity genes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2007， 104（15）： 6484-6489.

[21] 李朝闯， 马关鹏， 杨修勤， 等. 芥菜开花抑制因子SVP表达分析及其与FLC互作的调节位点鉴定[J]. 园艺学报， 2016， 43（8）： 1513-1524.

[22] Seo E， Lee H， Jeon J， et al. Crosstalk between cold response and flowering in Arabidopsis is mediated through the flowering-time gene SOC1 and its upstream negative regulator FLC[J]. Plant Cell， 2009， 21（10）： 3185-3197.

[23] 张治礼， 范鸿雁， 华  敏， 等. 菠萝开花诱导及其生理与分子基础[J]. 热带作物学报， 2012， 33（5）： 950-955.

责任编辑：黄东杰