甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E溶磷基因GDH和pqqE的克隆及溶磷特性分析

陈炯宇，覃英，谢显秋，黄毓燕，董登峰，邢永秀，李杨瑞

摘  要：葡萄糖脫氢酶（GDH）和吡咯喹啉醌（PQQ）对溶磷微生物溶解无机磷具有重要作用。本研究为了探讨甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯菌（Klebsiella variicola）DX120E的溶磷机制，从该菌中克隆溶磷基因GDH和pqqE的ORF，并进行了生物信息学分析，同时还研究了该菌对不同磷源的利用能力。结果表明：克隆得到甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E GDH和pqqE基因的ORF分别为2373 bp和1143 bp，编码氨基酸分别为790个和380个。生物信息学分析结果表明，GDH蛋白为稳定蛋白，pqqE蛋白为不稳定蛋白。GDH蛋白是一个与细胞信号传导有关的膜受体蛋白，具有PQQ_membr_DH、PQQ_mGDH功能域和PQQ_DH_like超家族蛋白结构;pqqE基因编码的蛋白是胞内蛋白，含有1个PQQ_syn_pqqE功能域和Radical SAM超家族蛋白的结构。内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E对不同磷源的利用和GDH和pqqE基因在不同磷源培养时的qRT-PCR分析表明，该菌对不同磷源的溶磷能力表现为FePO4>AlPO4>Ca3（PO4）2，且溶解FePO4的能力与溶解Ca3（PO4）2、AlPO4等难溶磷源的差异均显著（P<0.05）。在几种磷源条件下，GDH和pqqE基因相对表达量均增加，且2个基因的表达量变化趋势一致。GDH和pqqE基因在以FePO4为磷源条件下的表达量与以Ca3（PO4）2为磷源的表达量差异显著（P<0.05）。本研究可为进一步研究内生固氮菌与甘蔗的互作和溶磷机制提供参考。

关键词：甘蔗;Klebsiella variicola DX120E;GDH;pqqE;溶磷特性

中图分类号：S566.1      文献标识码：A

Cloning of Phosphorus-soluble Gene GDH and pqqE from Sugarcane Endogenous Nitrogen-fixing Bacteria Klebsiella variicola DX120E

CHEN Jiongyu1， QIN Ying1， XIE Xianqiu1， HUANG Yuyan1， DONG Dengfeng1， XING Yongxiu1*， LI Yangrui1，2*

1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement / Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement （Guangxi）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Sugarcane Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences / Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： Glucose dehydrogenase （GDH） and pyrroloquinoline quinone （PQQE） play an important role in the dissolution of inorganic phosphorus by phosphorus-soluble microorganisms. The phosphorus-soluble mechanism of the nitrogen-fixing bacteria Klebsiella variicola DX120E in sugarcane was investigated. The ORF of the phosphorous-soluble gene GDH and pqqE were cloned from the bacterium and analysised by bioinformatics. At the same time， the utilization ability of the bacteria to different phosphorus sources was studied. The ORF of GDH and pqqE was 2373 bp and 1143 bp， the coding amino acids were 790 and 380， respectively. Bioinformatics analysis showed that GDH was a stable protein， but pqqE was an unstable one. GDH was a membrane receptor protein related to cell signaling， with PQQ_membr_ DH， PQQ_mGDH functional domain and PQQ_DH_like superfamily protein structure. pqqE encoded proteins called intracellular proteins， structure containing PQQ_syn_pqqE functional domain and Radical SAM superfamily proteins. The utilization of different phosphorus sources and the qRT-PCR analysis of GDH and pqqE in different phosphorus sources showed that under different conditions， the ability of the bacteria to dissolve phosphorus was FePO4>AlPO4> Ca3（PO4）2 and the ability to dissolve FePO4 was significantly different from that of Ca3（PO4）2 and AlPO4（P<0.05）. Under the condition of several phosphorus sources， the relative expression of GDH and pqqE increased， and the expression change trend of the genes was the same. The expression of GDH and pqqE in phosphorus source was significantly different from that in Ca3（PO4）2（P<0.05）. This study would lay a foundation for further study on the interaction and phosphorus dissolution mechanism between endophytic nitrogen-fixing bacteria and sugarcane.

Keywords： sugarcane; Klebsiella variicola DX120E; GDH; pqqE; phosphorus-soluble characteristics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.010

磷是植物必需的大量元素，但大量的可溶性无机磷肥作为化肥施于土壤后大多被固定，植物无法利用[1]。广西是我国土壤含磷量较低的地区，土壤全磷含量一般为0.03%～0.15%，全磷含量低于0.06%的土地面积约占85%。施用的磷肥绝大部分保留于土壤中[2]。溶磷微生物在土壤中分布十分广泛，能使土壤中无机磷酸盐溶解或有机磷磷酸盐矿化，进一步提高土壤中磷的利用率，促进植物生长，提高作物的产量和品质[3-4]。前苏联学者蒙金娜首次报道巨大芽孢杆菌具有溶磷特性[5]。Jain等[6]从绿豆根际分离得到具有溶磷能力的曲霉S29（Aspergillus sp.），该菌能够溶解各种无机形式的磷酸盐，对绿豆生长有明显的促进作用。还有研究发现[7-10]溶磷微生物具有植物根际促生细菌（plant growth promoting rhizobacteria， PGPR）菌株的许多特性，能够产生生长素（IAA）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CK）及分泌铁载体等物质，促进植物对钾、钙、镁和锌等元素的吸收。不同作物间作也可提高土壤磷的利用效率[11-12]，为活化土壤难溶磷以促进作物生长提供了新思路。因此，具有溶磷能力的微生物对于环境保护和农业可持续发展战略实施具有重要意义。

具有溶磷能力的微生物通过分泌磷酸酶、葡萄糖脱氢酶（GDH）以及核酸酶等来溶解难溶性的无机磷或者有机磷，进而发挥溶磷作用[11]。吡咯喹啉醌（PQQ）是GDH等的辅酶，溶磷菌在GDH和PQQ以及金属离子如Mg2+或Ca2+的共同作用下参与葡萄糖酸溶磷代谢，溶解土壤无机或有机磷酸盐，将不溶性无机磷转化成可被植物吸收利用的有效磷，促进植物对营养的摄入和植物生长[12-13]。GDH的激活需要辅因子PQQ的参与才能产生葡萄糖酸，二者缺一不可[14]。PQQ由pqqABCDEF操纵子编码合成，包含pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF 6个基因在内的基因簇，其中pqqE对PQQ的生物合成至关重要[14-15]。本课题组Lin等[16]从广西大新县种植的甘蔗品种‘新台糖22号（ROC22）根内分离到一株变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E，该菌具有高固氮活性、分泌生长素和铁载体以及溶解无机磷特性等促生长特性，但其溶磷机制还未见报道。本研究通过克隆DX120E的溶磷基因GDH和pqqE，并分析其在不同难溶磷源的溶磷能力和基因相对表达量，探讨该菌溶磷能力及机制，研究结果可为进一步研究甘蔗内生固定菌DX120E与甘蔗的互作和溶磷机制奠定基础。

1  材料与方法

1.1  试验材料

菌株Klebsiella variicola DX120E为本课题组分离[16]。

1.2  试验试剂

克隆载体pMD18-T Vector、PCR扩增试剂、分子克隆试剂均购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司;大肠杆菌株DH5α购自北京全式金生物技术有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

1.3  引物设计合成

根据GenBank中登陆的GDH和pqqE基因的核苷酸序列，用Primer 5.0软件设计引物。引物序列如表1所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4  GDH和pqqE基因PCR扩增

以甘蔗内生固氮菌DX120E为模板，进行PCR扩增。扩增体系为25.0 μL反应体系：EsTaq Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增程序：预变性95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环;72 ℃ 6 min。扩增结束后在1.0%琼脂糖凝胶糖1.0 TAE电泳缓冲液中进行电泳。

1.5  GDH和pqqE基因的生物信息學分析

参考孟富宣等[17]和范晓军等[18]采用的生物信息学分析方法：用NCBI ORF finder（http：//www. Ncbi.Nlm.nih.gov/gorf/gorf.htm1）进行开放阅读框查找;用BioXM 2.6预测该基因的氨基酸序列;用ExPASy（http：//expasy.org/tools/）对该基因推测蛋白质序列的基本理化性质进行分析;用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignaIP/）进行信号肽预测;用GenBank Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）在线分析软件分析甘蔗GDH和pqqE基因与其他物种的同源性;用TMHMMServer2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）进行跨膜结构分析;利用MotifScan、protein blast程序（http：//blast.ncbi.nlm. nih.gov/ Blast.cgi）分别对GDH和pqqE的蛋白质功能和保守结构域进行分析。

1.6  DX120E对不同难溶磷源的溶磷能力测定

按照NBRIP培养基的组分含量，将Ca2（PO4）3改为AlPO4、FePO4，质量不变，制成液体培养基。挑取在平板中生长的单菌落，将其接入液态LB培养基之内，调整至150 r/min和37 ℃的条件进行培养，再调节菌液使其OD600=1.0，这样便得到了种子液。取300 μL种子液接入含有10 mL液态LB培养基的指型瓶中，同样选择150 r/min和37 ℃的条件来培养，做3个重复，同时以接入的无菌水作为对照实验，培养后用钼锑抗比色法评价溶磷效果[19]。

1.7  不同难溶磷源中GDH和pqqE基因相对表达量分析

用Primer 5设计基因的荧光定量引物，内参基因选用DX120E 16S RNA基因，设计引物（表2）。荧光定量PCR体系和反应程序依照试剂盒说明书进行（Vazyme公司的ChamQ TM Universal SYBR?qPCR Master Mix）。各處理均进行生物学重复处理3次，技术性重复3次，采用2–??Ct法分析不同磷源条件下GDH和pqqE基因的相对表达量。

1.8  统计分析

利用SPSS 21.0软件进行试验数据处理及差异显著性分析，利用Graphpad软件制图。

2  结果与分析

2.1  GDH和pqqE基因的克隆

以甘蔗内生固氮菌DX120E为模板，用所设计的引物进行PCR扩增，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增所得到片段大小与预期的扩增片段大小相符，GDH和pqqE基因的片段大小分别约为2000 bp和1000 bp（图1）。将经回收纯化的产物与pMD18-T载体连接并转化感受态DH5α，所筛选出的阳性克隆送深圳华大基因测序。测序结果GDH和pqqE基因分别为2373 bp和1143 bp。GDH基因GenBank登录号为MW026649，编码790个氨基酸（图2）。pqqE基因GenBank登录号为MW026650，编码380个氨基酸（图3）。

M：DL5000 marker;1：GDH基因;2：pqqE基因。

M： DL5000 marker; 1： GDH gene; 2： pqqE gene.

2.2  GDH和pqqE基因生物信息学分析

2.2.1  理化性质分析  应用蛋白质在线分析软件系统ExPASy分析GDH蛋白，显示GDH蛋白理论分子质量为85.05 kDa，pI为6.62，分子式为C3840H5941N1021O1103S31;其中甘氨酸（Gly）含量最高，为10.9%，丙氨酸（Ala）次之，为9.4%，带正电荷的氨基酸为63个，带负电荷的氨基酸为65个。不稳定指数为34.36，为稳定性蛋白。

pqqE蛋白分子量为42.99 kDa，pI为5.90，分子式为C1904H2967N531O564S21;其中亮氨酸（Leu）含量最高，为10.8%，丙氨酸（Ala）次之，为9.2%，总带正电荷的氨基酸为43个，带负电荷的氨基酸为48个。不稳定指数为49.32，为不稳定性蛋白。

2.2.2  信号肽预测  用SignalP 4.1在线软件对GDH和pqqE蛋白进行信号肽预测，结果表明GDH和pqqE的蛋白均无信号肽，不属于分泌型蛋白（图4）。

A：GDH;B：pqqE。

2.2.3  跨膜区结构预测  通过TMHMM在线软件进行蛋白跨膜螺旋结构分析，如图5A所示，GDH基因的编码产物存在6个跨膜螺旋（TMHs）结构，该蛋白是跨膜蛋白，也存在跨膜结构。pqqE蛋白不含跨膜结构，为一种外膜蛋白（图5B）。

A： GDH; B： pqqE.

2.2.4  蛋白质二级结构预测  利用SOPMA预测GDH蛋白的二级结构，得知该蛋白含有-螺旋、β-链、β-折叠和无规则卷曲，其中主要为无规则卷曲，占51.90%，其次为β-链占23.16%，-螺旋，占16.71%，β-折叠只占8.23%（图6A）。pqqE蛋白的二级结构含有-螺旋、β-链、β-折叠和无规则卷曲，其中主要为无规则卷曲占45.53%，其次为-螺旋，占38.16%，β-链占12.37%，β-折叠只占3.95%（图6B）。

A：GDH;B：pqqE;h：-螺旋;e：β-链;

t：β-折叠;c：无规则卷曲。

A： GDH; B： pqqE; h： -helix; e： β-chain; t： β-fold; c： Random coil.

2.2.5  蛋白功能结构域进行分析  用Motif Scan软件对GDH和pqqE蛋白功能结构域进行分析。结果显示，在GDH蛋白中，173-176、209-212、354-357、541-544、601-604为N-糖基化位点;149-152、175-178、211-214、242-245、311-314、356-359、432-435、459-462、543-546、553-556、629-632、667-670、684-687为酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;26-31、33-38、279-284、348-353、362-367、392-397、428-433、519-524、586-591、630-635、640-645、664-669、707-712为N-肉豆蔻酰化位点;242-244、286-288、305-307、371-373、491-493、673-675、756-758、759-761为蛋白激酶C磷酸化位点;431-438、772-780为酪氨酸激酶磷酸化位点。在pqqE蛋白中，226-229、367-370为N-糖基化位点;65-68、71-74、101-104、277-280、308-311为酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;95-100、131-136、199-204、225-230、244-249、317-322、328-333为N-肉豆蔻酰化位点;19-21、71-73、267-269为蛋白激酶C磷酸化位点;80-88为酪氨酸激酶磷酸化位点。

2.2.6  蛋白保守结构域分析  用protein blast程序对GDH蛋白进行预测。结果表明（图7A），GDH蛋白含有3个功能域，分别为PQQ_membr_ DH、PQQ_mGDH、Gcd;含有3个超家族蛋白结构，其中最主要的是PQQ_DH_like超家族蛋白结构。PQQ_membr_DH功能域的系统发育分布与辅酶PQQ生物合成酶非常相似。在N-末端区域有几个已预测到的跨膜螺旋的序列与PQQ所依赖的甘油（EC1.1.99.22）和其他多元醇（糖醇）脱氢酶具有同源性。PQQ_mGDH功能域的细菌亚家族属于以吡咯喹啉醌（PQQ）为辅助因子的脱氢酶家族，是唯一与膜结合的亚家族。葡萄糖脱氢酶将D-葡萄糖转化为D-葡萄糖-1，5-内酯，在革兰氏阴性菌糖和醇的周质氧化反应中与呼吸链偶联。PQQ_DH_like超家族蛋白家族包含一个8叶β-螺旋桨，由以吡咯喹啉醌（PQQ）为辅助因子的脱氢酶组成，如乙醇、甲醇和膜结合葡萄糖脱氢酶。

保守结构域分析显示（图7B），pqqE蛋白含有1个PQQ_syn_pqqE功能域，是一种典型的肽环化自由基SAM酶。将Tyr连接到Glu是从前体肽PqqA合成吡咯喹啉醌（辅酶PQQ）的第一步。该蛋白含有Radical SAM超家族蛋白的典型结构，该家族是一个协调保守的铁硫簇CxxxCxxC基序，其中酶通过将4Fe-4S簇和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）紧密结合而产生自由基，再将共享单个电子从铁硫簇转移到SAM后还原裂解为蛋氨酸和5-脱氧腺苷自由基，随后反过来又从适当位置的碳原子中提取氢。根据酶的不同，SAM在此过程中被消耗或恢复和重复使用。自由基SAM酶起着催化代谢、DNA修复、维生素和辅酶的生物合成以及许多抗生素的生物合成的作用。此外，还会催化不同的反应，包括不寻常的甲基化、异构化、硫插入、环形成、厌氧氧化和蛋白质自由基形成。

A： GDH; B： pqqE.

2.2.7  氨基酸序列同源性分析  用MEGA 6.0软件构建系统进化树，结果显示（图8A，图8B），菌株DX120E的GDH和pqqE蛋白与克雷伯氏菌属的亲缘关系最近。

2.3  DX120E对不同磷源的溶磷能力

图9A所示，在3种不同难溶磷源条件下，DX120E的溶磷量均高于对照，其中以FePO4为难溶磷源时显著高于对照。图9B所示，溶磷量以FePO4为难溶磷源的条件下最高，以Ca3（PO4）2为难溶磷源的条件下最低。以FePO4为难溶磷源时与以Ca3（PO4）2、AlPO4为难溶磷源时的溶磷量相比均达到显著性差异（P<0.05），以Ca3（PO4）2、AlPO4为难溶磷源时分别是以FePO4为难溶磷源条件下的1.4和1.6倍。

A： GDH; B： pqqE.

A：与CK对比;B：3种不同磷源的对比;不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

A： Comparison with CK; B： Comparison of three different phosphorus sources; Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level.

2.4  不同难溶磷源中GDH和pqqE基因相对表达量分析

对在不同难溶磷源条件下DX120E的样品进行qRT-PCR试验分析，GDH和pqqE基因相对表达量如图10所示，GDH和pqqE基因相对表达量均呈上调表达，且2个基因的表达量情况趋势一致。GDH和pqqE基因在以FePO4为难溶磷源的培养条件下表达量均最高，以Ca3（PO4）2为难溶磷源的条件最低，以FePO4为难溶磷源培养与以Ca3（PO4）2为难溶磷源培养的菌株2个基因的表达量均达到显著差异（P<0.05），其中GDH和pqqE

A：GDH;B：pqqE;不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

A： GDH; B： pqqE; Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level.

基因表达量分别是以Ca3（PO4）2为难溶磷源条件下的1.3和1.8倍。

3  讨论

磷是植物生长的必需元素之一，但土壤中绝大多数的磷元素均以难溶性状态存在。溶磷微生物能将不可溶解的矿质磷酸盐转化为可溶解性的H2PO4–或者HPO42–供植物吸收利用，这也是全球磷循环生态系统的基本组成[20]。溶磷细菌在GDH和辅因子PQQ同时存在时，不溶性的矿质磷酸盐可以转化为供生物体吸收利用的可溶性磷，缺少二者中的任何一个，都会影响解磷能力。GDH基因对菌株的溶磷功能具有决定性作用。Tripura等[21]成功地从肠杆菌（Enterobacter asburiae）中克隆了GDH基因，缺失GDH基因的突变体便丧失GDH的活性，致使该菌不能溶解土壤中的难溶性磷酸盐[22]。Rodríguez等[23]将pqq基因导入到Burkholderia cepacia IS-16和假单孢菌属（Pseudomonas.sp）2个菌株，发现构建的突变菌株能增强矿质磷酸盐溶解能力。

本研究成功克隆了甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E的GDH和pqqE基因ORF，并推导出编码的氨基酸序列。GDH基因ORF为2373 bp，编码790个氨基酸。蛋白理化性质稳定。由于该蛋白无信号肽，不是分泌型蛋白。GDH蛋白是跨膜蛋白，也存在跨膜结构，表明GDH蛋白可能是一个与细胞信号传导有关的膜受体蛋白。激酶磷酸化位点总共有23个，磷酸化作用是蛋白质性质改变的方法之一，磷酸化位点被激活后对蛋白的结构、功能特性都有重要影响。磷酸化作用是对蛋白质结构进行修饰，这对细胞的信号转导也发挥着不可替代的作用[24]。该片段主要含有PQQ_membr_DH、PQQ_mGDH功能域和PQQ_DH_like超家族蛋白结构。pqqE基因ORF为1143 bp，编码380个氨基酸。蛋白理化性质不稳定。由于该蛋白无信号肽，也不是分泌型蛋白，说明该蛋白的作用存在于胞内，不具备运输蛋白质到不同膜结构的亚细胞器内的功能。激酶磷酸化位点共有9个，2个糖基化位点，与其磷信号识别与传导的作用有关。该片段含有1个PQQ_ syn_pqqE功能域和Radical SAM超家族蛋白的结构。本研究从固氮菌株DX120E中克隆获得了GDH和pqqE基因，说明该菌株可以通过产酸途径来降解难溶性的磷酸盐，但具体的溶磷机制还需进一步深入研究。

酸性土壤中磷素常被固定生成磷酸铝或磷酸铁，碱性土壤中磷易被固定生成磷酸钙的形式存在，大大降低了磷的有效吸收和利用。而土壤中的一些微生物能将土壤中难溶性的磷酸盐转变成可溶性磷源，能使植物更多地吸收利用磷素。解磷微生物在农业上的应用，不仅可以减少使用化肥所带来不良效益，而且可以通过增加土壤中的营养元素促进作物生长[25]。赵买琼[26]将筛选出的高效解磷菌株假单胞菌Y2与解淀粉芽孢杆菌T5、NJN6 结合再配以一定比例的无机化肥，研制成复合微生物肥料，结果显示对番茄、茄子、马铃薯、玉米、烟草等均具有较好的促生效果。孙孝文等[27]从水稻根际土壤中筛选到水生拉恩氏菌MEM40对磷酸钙、磷酸镁和磷矿粉均具有明显的解磷效果，对水稻具有明显的促生作用。不同的细菌其溶磷能力不同，王奎萍等[28]筛选得到134株具有溶磷能力的菌株使辣椒植株的生物量增加了10.24%。唐岷宸等[29]研究发现解磷菌X-P18的施用能夠使叶葵扇白菜在缺磷环境中大量增产，其中鲜重增加了65.5%，叶片中全磷增加46.9%，促进农作物对养分的吸收利用。吕俊等[30]从马尾松根际筛选到伯克霍尔德菌WJ2对磷酸钙的溶解能力最强，在盆栽试验中，菌株WJ2可提高土壤有效磷含量，促进植株对磷素的吸收，促进马尾松幼苗的生长。甘蔗内生固氮菌DX120E是具有多种促生特性的溶磷细菌[16]。本研究测定了在不同难溶磷源的培养条件下DX120E的溶磷量以及相应条件下GDH和pqqE基因相对表达量。结果发现，以FePO4为难溶磷源的条件下溶磷量最高，GDH和pqqE基因的相对表达量也最高。以Ca3（PO4）2为难溶磷源的条件下溶磷量和相对表达量均最低。说明在以FePO4为难溶磷的土壤中应用该菌，可以提高土壤磷素的利用效率，从而促进植物的营养吸收和生长。

总之，本研究从甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E中克隆获得了GDH和pqqE基因，从分子方面证实该菌可通过葡萄糖脱氢酶的作用，产生有机酸途径来发挥溶磷作用。同时Klebsiella variicola DX120E对FePO4和AlPO4的利用能力高于Ca3（PO4）2，可见该菌在酸性土壤中的应用潜力更大。本研究结果为进一步深入研究内生固氮菌的溶磷机制及开发利用提供了参考。

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责任编辑：黄东杰