枸树干基腐朽病病原菌鉴定及其生物学特性研究

单金雪，李增平，张宇，王晓宇，胡真臻，朱清亮，陈献镭

摘  要：2018年12月在海南省儋州市的枸树活立木上发现一种由灵芝属真菌引起的干基腐朽病，从病树上采集新鲜的担子果，组织分离法分离病原菌，对其进行科赫氏法则验证，明确该菌为致病菌。采用ITS-SSU-LSU多基因联合构建系统发育树，通过形态学特征及分子生物学鉴定为南方灵芝[Ganoderma australe （Fr.） Pat.]，生物学特性测定结果表明该病原菌在溫度条件为25～32 ℃范围内生长较好，最适温度为28 ℃，适宜生长pH为4～7，最适pH为6，在CA、PDA、PSA培养基上生长状态较好，最适培养基为PDA培养基，光照对病原菌菌丝的生长有抑制作用。

关键词：枸树;茎腐病;南方灵芝;生物学特性

中图分类号：S763.7      文献标识码：A

Identification and Biological Characteristics of Pathogen of Stem Rot of Broussonetia papyrifera

SHAN Jinxue， LI Zengping*， ZHANG Yu， WANG Xiaoyu， HU Zhenzhen， ZHU Qingliang， CHEN Xianlei

College of Plant Protection， Hainan University / Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： In December 2018， a stem rot disease was found on Broussonetia papyrifera in Danzhou City， Hainan Province. Basidiocarps related to the disease were collected. The pathogenic pathogen was isolated by the conventional tissue separation method， and the pathogenicity was determined. The phylogenetic tree was constructed by ITS-SSU-LSU multi-gene combination. It was identified as Ganoderma australe by morphology and molecular biology. The results of biological characteristics showed that the pathogen grew well in 25-32 ℃， the optimal temperature was 28 ℃， the optimal growth pH was 4-7， and the optimal growth pH was 6. It grew well on CA， PDA and PSA medium， the optimal medium was PDA medium; light had inhibitory effect on the growth of mycelia of the pathogen.

Keywords： Broussonetia papyrifera; stem rot; Ganoderma australe （Fr.） Pat.; biological characteristics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.027

枸树（Broussonetia papyrifera）也称为构树，是桑科、枸树属的一种落叶乔木，高10～20 m，适应性强，具有喜光、速生、抗逆性强等特点。枸树在我国大部分地区都有分布。由于其对灰尘、烟尘和高温的高度耐受性，果实及根可入药，嫩叶可作猪饲料等，枸树被认为是生物群落多样性中很重要的组成部分，并广泛用于医学、畜牧业、造纸等多个领域，具有很高的经济价值[1-3]。

目前关于枸树病害的相关报道主要集中在叶部病害，主要有枸树细菌性叶斑病[4]，由病毒引起的枸树叶片卷曲病[5]，真菌病害有枸树褐斑病[6]、枸树叶片黑斑病[7]。尚未发现由灵芝属真菌引起枸树干基腐朽病的有关报道。笔者从海南儋州军屯的枸树活立木上发现一种由灵芝属真菌引起枸树干基腐朽病，从病树茎干上采集新鲜的担子果并进行分离培养，对分离得到的菌株进行鉴定，并完成致病性测定和生物学特性研究，为研究枸树茎腐病的发病规律及防治技术等提供理论基础。

1  材料与方法

1.1  材料

于2018年12月31日从海南省儋州市军屯的枸树活立木茎基部采集到与病害相关的灵芝担子果，分离病原菌，并对标本进行风干保存。供试植株为海南大学教学实习基地内种植的1年生枸树苗。

木屑培养基、PDA、PSA、CA、OMA、CMA、Richards、枸树枝条浸汁培养基的配制方法参照文献[8-10]。

1.2  方法

1.2.1  菌株分离  在担子果表面用浸湿无菌水的湿棉花轻轻擦拭，用灭菌手术刀切去表层，从新鲜露出的部分切取小块组织移到PDA平板上培养，对生长出来的菌落进行纯化，从多个生长形态相同的菌株中选取其中长势较好的1株编号为GSJF001，保存备用。

1.2.2  接种体制备  从GSJF001菌落上挑取适量菌丝块放置于袋装木屑培养基内，用报纸包裹放置于适宜温度下培养30 d左右，待整个培养基布满菌丝，用于致病性测定。

1.2.3  致病性测定  对枸树幼苗的基部茎干表面喷洒70%酒精进行消毒，待表面干燥，用灭菌手术刀削去茎干表皮引起轻微伤口，将布满病原菌菌丝的接种体紧贴伤口处，用保鲜膜进行捆绑固定，并用无菌水浸过的湿棉花进行保湿，相同操作接空白的接种体作为对照，每处理重复5次。每隔1周观察枸树长势，并拍照。

1.2.4  担子果诱导  从GSJF001菌落取少量菌丝块置于瓶装木屑培养基中，于常温条件下培养，定期观察菌丝生长情况。

1.2.5  菌株鉴定  依据文献[11]对病原菌的担子果进行表观形态鉴定，用摄影生物显微镜对担子果的显微结构进行观察、测量并拍摄图片。将GSJF001菌株培养5 d后，提取其总DNA。采用通用引物ITS、小亚基（SSU）、大亚基（LSU）扩增基因序列（表1）。扩增产物纯化、回收后，送铂尚生物技术（上海）有限公司测序。将得到的有关序列在NCBI数据库上进行比对，并提交，下载保存相关序列和登录号（表2）。利用Sequence Matrix软件进行序列拼接，使用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

1.2.6  GSJF001菌株生物学特性测定  在超净工作台上，用无菌打孔器（直径5 mm）在生长5 d的病原菌菌落边缘打取菌饼，将菌饼接种到不同处理条件的平板上，培养5 d后用十字交叉法测量菌落直径。

（1）不同温度条件：将菌饼置于PDA平板上，分别置于15、20、25、28、30、32、35、40 ℃共8个温度梯度下黑暗条件下培养。

（2）不同光照条件：将菌饼置于PDA平板上，分别置于黑暗、12 h光暗交替、完全光照3种不同光照条件下，28 ℃培养。

（3）不同pH条件：用1 mol/L HCL和1 mol/L NaOH将PDA培养基的pH分别调至2、3、4、5、6、7、8、9、10共9个梯度，制成平板后接入菌饼，于28 ℃恒温黑暗条件下培养。

（4）不同培养基条件：将菌饼分别置于PDA、PSA、CA、OMA、CMA、Richards和枸树枝条浸汁培养基下，于28 ℃恒温黑暗培养。

1.3  数据处理

采用Excel 2013和SAS 8.1软件对数据进行统计和差异显著性分析。

2  结果与分析

2.1  田间发病症状

枸树发病初期，树冠上的部分叶片失绿发黄，萎垂，脱落，继而整株叶片失水萎蔫，树冠稀疏，后期部分枝条在叶片脱落后枯死，病株生长不良，重病株整株枯死。病树下部茎干和茎基部侧面长出檐状的褐色或黑褐色担子果，内部木质部组织出现白色腐朽，有时可见担子果上表面覆盖有一层黄褐色泥层状的担孢子粉（图1）。

2.2  致病性测定

接种GSJF001菌株50 d后，枸树苗叶片失绿发黄，萎垂，长势减弱，接种部位布满白色菌丝（图2A，图2B），并长出形态相同的担子果（图2C，图2D），对照株伤口愈合，内部组织正常，长势良好（图2E）。从发病木质部再分离获得与GSJF001相同的菌株，表明菌株GSJF001为致病菌。将GSJF001接种至瓶装木屑培养基，5个月后长出的担子果与从病树采集到的担子果形态特征相同（图2F）。

2.3  病原菌鉴定

2.3.1  形态鉴定  在PDA培养基上，GSJF001菌株的菌落呈现白色，菌丝为致密的绒毛状（图3A）。

担子果一年到多年生，（10～12）cm×（22～24）cm，厚約3.5 cm，半圆形或扇形，有明显的同心环棱或无，木栓质，无柄，无漆样光泽，正面为褐色，反面灰白色，菌肉呈现肉桂色（图3B，图3C）。新鲜孢子为南瓜子形，双层壁，褐色或淡褐色，大小为（5.3～6.6）?m×（8.5～11.3）?m（平均6.0 ?m× 10.0 ?m），顶端无色透明，担孢子中央有一个较大的油滴;老熟担孢子小端平截，无色部分消失，大小为（5.2～6.6）?m×（7.3～9.0）?m（平均6.1 ?m×8.3 ?m），双层壁明显，颜色略深（图3D）。缠绕菌丝浅黄褐色，多分枝，大约呈直角，直径2～3 ?m（图3F）;生殖菌丝透明，薄壁，直径3～6 ?m;骨架菌丝浅褐色，具树状分支直径3～5 ?m（图3G）。

2.3.2  分子鉴定  测序得到GSJF001菌株的rDNA-ITS序列为629 bp（登录号：MW193047），在NCBI上进行BLAST比对，与登录号为MN696209.1的G. australe相似性达99.68%;rDNA-SSU序列为1000 bp（登录号：MW227479），与登录号为MN747807.1的G. australe相似性达99%;得到rDNA-LSU序列593 bp（登录号：MW227480.1），BLAST比对结果与登录号为MN689633.1的G. australe相似性达99.31%。将3种序列进行拼接并联合构建系统发育树，结果表明GSJF001与G. australe聚为一类（图4），结合形态学分析，菌株GSJF001被鉴定为南方灵芝（Ganoderma australe）。

2.4  不同温度、pH、光照条件对GSJF001菌株菌落生长的影响

温度对GSJF001菌株生长的影响差异明显，温度条件在25～32 ℃时菌株生长状态较好，在温度28 ℃条件时生长最快，40 ℃时不生长。菌株GSJF001在pH为2和10时均不生长，pH为6.0时最适宜菌株的生长。菌株对光照条件较为敏感，在完全光照的条件下生长速度最慢，在12小时光暗交替条件下由于受光照的影响其生长速度也较黑暗条件下慢，在28 ℃全黑暗、pH为5的条件下最适宜GSJF001菌株生长。

2.5  不同培养基对GSJF001菌株菌落生长的影响

GSJ001菌株在7种不同处理条件的培养基上菌丝生长速度和形态特征差异明显，在PDA和CA平板培养基上生长最快，但在CA培养基上菌落菌丝不如PDA上浓密，故菌株最适生长培养基为PDA培养基（表3）。

3  讨论

有关枸树病害的研究报道主要包括细菌、真菌及病毒引起的叶部病害[4-7]，尚无枸树茎腐病的报道。本研究对引起海南省儋州军屯的枸树干基腐朽病的病原菌进行形态学和分子生物学鉴定，结果表明该病原菌为南方灵芝[Ganoderma australe （Fr.） Pat.]，这是南方灵芝引起枸树茎腐病的首次发现。南方灵芝是灵芝科灵芝属的一种担子菌，也是一种病原木腐真菌，它可以侵染许多阔叶树的树干和茎基部，引起白色腐烂，在严重的情况下，它可以导致树木死亡。南方灵芝分布较广泛，主要分布在华中、华东和华南地区[15]。国内外关于南方灵芝的研究较多的是南方灵芝子实体的次生代谢产物和生物降解方面[16-18]，胡真臻等[19]和王晓宇等[20]研究报道了由南方灵芝引起的橡胶树和油梨茎腐病。陈礼浪等[21]通过对海南木麻黄木腐菌调查，发现了包括南方灵芝在内的6种病原灵芝木腐菌，包括南方灵芝。Ayin等[22]发现南方灵芝是引起关岛木麻黄长势下降的病原菌，但并未进行科赫氏法则验证。Glen等[23]对马占相思和其他热带树木上根腐病相关的担子果进行形态学特征和DNA序列鉴定，发现了多种病原灵芝菌，其中包括南方灵芝。

本文对枸树茎腐病病原菌的生物学特性进行了研究，结果表明，该病原菌在25～32 ℃时生长状态较好，28 ℃为病原菌最适培养温度，黑暗条件下最有利于病原菌的生长，最适生长的pH为6.0，在7种不同培养基中菌丝生长状态有所不同，在PDA、CA和PSA三种平板上生长状态较好，且在PDA平板上菌丝生长状态最好，生长速度最快，菌丝最为致密，这与王晓宇等[20]对南方灵芝生物学特性的研究基本相同。本研究中南方灵芝病原菌所导致枸树发生茎腐病的症状与先前报道的南方灵芝引起的茎腐病大致相同，发病时都表现为树冠稀疏，根茎部组织部出现白色腐朽，多雨季节长出担子果，较为严重时，树木死亡。

该病的防治应当以预防为主，并进行综合防治。清除田间杂树桩，定期检查，及时清沟排除积水，对风害、寒害后受伤的树木进行防腐处理，防止伤口受灵芝菌的侵染，对树木基部茎干涂刷保护剂进行保护。一但发现病死树要及时砍除病树及挖除病根并烧毁。

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責任编辑：谢龙莲