半乳糖凝集素-1对高氧诱导急性肺损伤新生鼠的保护作用及机制研究

李萌萌，王 宁

(西安大兴医院儿科，陕西 西安 710016)

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)指由各种直接或间接致伤因素引起的肺泡组织损伤，可导致急性低氧性呼吸功能不全，严重者可发展为急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)，并最终导致患者多器官功能衰竭甚至死亡[1-2]。其发病机制尚不明确，目前较为公认的机制为各种因素诱导肺内大量炎症因子激活和释放，从而导致肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞受损，肺内皮细胞通透性增加，引发肺水肿，进而影响肺换气效能[3]。目前临床对ALI的治疗方案主要通过机械通气以维持氧供，并给予表面活性剂、糖皮质激素、抗生素及抗氧化剂等对症治疗，并无特效药物[4]。半乳糖凝集素-1(Galectin-1，Gal-1)是凝集素超级家族中的重要成员，在心、脑、肺、肾、淋巴结等多种组织器官，以及内皮细胞、巨噬细胞、骨髓基质细胞等不同类型细胞中均广泛表达，在细胞黏附、细胞生长、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤转移等众多生理病理过程中均发挥重要作用[5-6]。研究[7-8]发现，Gal-1呈现独特的抗炎和抗氧化应激作用，因此本研究将Gal-1用于高氧诱导的ALI大鼠的治疗，观察其对肺损伤大鼠肺组织的保护作用，并探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 足月新生Wistar大鼠30只，由南京青龙山动物繁殖场提供，许可证号为SCXK(苏)2019-0906，饲养于恒温(21～26 ℃)、恒湿(45%～65%)的洁净动物房内，间隔12 h日夜循环，给予自由进食、饮水。

1.2 主要试剂 Gal-1(批号：1152-GA/CF)购自美国R&D公司；4%多聚甲醛溶液(批号：180813)购自康迪斯化工(湖北)有限公司；活性氧(ROS)检测试剂盒(批号：190725)购自武汉富鑫远科技有限公司；BCA蛋白检测试剂盒(批号：A72430FA9)购自上海吉至生化科技有限公司；总RNA提取试剂盒(批号：WXBC8980V)购自上海吉至生化科技有限公司；TRIzol试剂(批号：50175111)购自美国赛默飞世尔科技公司；反转录试剂盒(批号：00217889)购自美国Fermentas公司；核因子E2相关因子2(Nrf2)、 血红素氧合酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶-1(NQO-1)、 磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)等试剂盒购自美国Invitrogen公司；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(批号：E-EL-0033c)购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 造模、分组及给药方案：将30只足月新生Wistar大鼠随机分为对照组、高氧组和高氧+Gal-1组，每组10只。对照组大鼠自由呼吸常压空气。高氧组和高氧+Gal-1组大鼠置于玻璃材质高氧箱中，底部铺入钠石灰以吸收箱内CO2，保持CO2浓度<0.5%，持续向箱内通入医用氧气，用测氧仪每日检测氧浓度3次，确保其中氧浓度≥85%。高氧+Gal-1组大鼠在置于高氧箱前1 h腹腔注射3 μg Gal-1溶液。各组大鼠均在实验开始12 h以后处死，进行取样分析。

1.3.2 组织学观察：处死大鼠后，取部分左肺组织置于4%多聚甲醛溶液中室温放置48 h，脱水、包埋、制作石蜡切片后进行苏木精-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察组织形态。

1.3.3 肺干湿比(W/D)测量：以4 ℃ PBS缓冲液缓慢冲洗肺循环，分离左肺后迅速称重，记录湿肺重量。将湿肺置于80 ℃烘箱中烘干72 h后再次称重，记录干肺重量。最后，计算W/D值。

1.3.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)采集：处死大鼠后，通过气管向肺内缓慢注入4 ℃ PBS缓冲液1 ml，再缓慢抽出，反复3次，最后一次抽出的液体即为BALF，在4 ℃下以1500 r/min离心10 min，取上清-80 ℃冻存备用。

1.3.5 BALF中炎症因子测定：采用ELISA检测BALF中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)的表达水平。

1.3.6 ROS、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测定：取部分左肺组织，称重后加入PBS缓冲液制备成10%匀浆，4000 r/min离心10 min。取上清，采用荧光酶标仪检测ROS表达水平，采用黄嘌呤氧化酶(XOD)法检测SOD浓度，采用硫代巴比妥酸(TBA)法检测MDA浓度。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.7 Nrf2、 HO-1、NQO-1 mRNA检测：采用TRIzol试剂提取肺组织RNA，用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA文库，以β-actin为内参，计算各个基因的相对表达水平。引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

1.3.8 Nrf2、AMPK蛋白表达检测：取部分肺组织，PBS洗涤3次，剪碎后过200目钢筛研磨。收集研磨后的肺组织加入裂解液，提取组织中总蛋白，按试剂盒说明书采用Western blot测定各蛋白表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验或方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组大鼠肺组织病理学形态比较 对照组大鼠肺组织结构规则完整，肺泡大小一致、间隔均匀，无水肿肺泡，无炎性细胞浸润。高氧组大鼠肺组织结构紊乱，肺泡管腔增大，肺间质呈现充血或出血样改变，有大量纤维渗出或炎性细胞浸润。高氧+Gal-1组可见少量纤维渗出或炎性细胞浸润，肺泡损伤程度介于对照组和高氧组之间。

2.2 三组大鼠肺W/D值比较 见图1。与对照组相比，高氧组肺W/D值明显升高(P<0.05)。而高氧+Gal-1组大鼠因使用Gal-1预处理，肺W/D值低于高氧组(P<0.05)。

2.3 三组大鼠炎症因子表达水平比较 见图1。高氧组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平显著高于对照组，而经Gal-1预处理的高氧+Gal-1组大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平则显著低于高氧组(均P<0.05)。

注：与对照组相比，*P<0.05；与高氧组相比，#P<0.05

2.4 三组大鼠ROS、SOD、MDA表达水平比较 见表2。高氧组大鼠肺组织中ROS和MDA的表达水平显著高于对照组，SOD的表达水平显著低于对照组(均P<0.05)。用Gal-1预处理的高氧+Gal-1组大鼠ROS和MDA的表达水平显著低于高氧组，SOD的表达水平显著高于高氧组(均P<0.05)。

表2 三组大鼠ROS、SOD、MDA表达水平比较

2.5 三组大鼠Nrf2、 HO-1、NQO-1 mRNA表达水平比较 见图2。与对照组和高氧组相比，高氧+Gal-1组大鼠肺组织中Nrf2 mRNA的表达水平显著升高(均P<0.05)。另外，高氧+Gal-1组Nrf2下游基因HO-1和NQO-1的表达水平也显著高于对照组和高氧组(均P<0.05)。

2.6 三组大鼠pAMPK/AMPK和Nfr2蛋白表达水平比较 见图3。高氧+ Gal-1组pAMPK/AMPK表达水平显著高于对照组和高氧组(均P<0.05)。高氧+Gal-1组Nfr2蛋白的表达水平显著高于高氧组(P<0.05)；而在AMPK抑制剂Compound C(Com C)存在的情况下，高氧+Gal-1+Com C组Nfr2蛋白的表达水平显著低于高氧+Gal-1组(P<0.05)。

注：与对照组比较，*P<0.05

注：与对照组比较，*P<0.05；与高氧组比较，#P<0.05；与高氧+Gal-1组比较，△P<0.05

3 讨 论

ALI及其严重形式ARDS均为临床常见危重疾病，患者肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞受损，导致弥漫性肺间质及肺泡水肿，表现为低氧合、低肺顺应性、高生理死腔和通气/血流比失调等的病理生理特征[9]，患者住院时间长、病死率高。半乳糖凝集素在机体的先天性和适应性免疫应答中均起到关键作用[10]。Correa等[11]研究表明，外源性Gal-1可通过抑制硝基酪氨酸的表达来减轻肾脏的氧化应激，从而减弱由缺血再灌注导致的肾脏损伤。Abebayehu等[12]研究显示，Gal-1可通过促使巨噬细胞向M2表型分化，从而对抗ALI的发生与发展。本研究中，Gal-1预处理的大鼠肺部组织结构与高氧组相比较为规则完整，纤维渗出或炎性细胞浸润均较少，肺泡损伤程度更轻；同时，高氧+Gal-1组大鼠肺泡W/D值显著低于高氧组，表明Gal-1可有效改善高氧诱导的ALI。

炎症反应和氧化应激在ALI的发生与发展中起重要作用。高氧暴露下机体产生大量 ROS，后者具有高度氧化活性，可氧化酶、核酸、结构蛋白等，从而导致肺泡毛细血管膜的破坏和上皮细胞的死亡，进而造成肺泡水肿和血氧交换受阻[13]。SOD对于防止氧化应激至关重要，其可通过抗氧化和抗自由基的功能有效抵御氧自由基对机体的损伤[14]。MDA在机体内的表达水平可体现体内氧自由基的水平，进而反映机体氧化应激的损伤程度[15]。本研究中，经Gal-1预处理的高氧+Gal-1组大鼠BALF中的TNF-α、IL-1β、IL-6、ROS和MDA的表达水平显著低于高氧组，SOD的表达水平显著高于高氧组，提示Gal-1可减轻高氧诱导的炎症反应和氧化应激，从而起到改善ALI的作用。

Nrf2是广泛存在于动物体内的防御氧化应激的关键转录因子，可与抗氧化反应元件(ARE)相结合而启动器下游抗氧化基因，如HO-1和NQO-1等，从而抵御各种原因导致的细胞内氧化应激状态[16]。Lei等[17]和Chen等[18]研究均显示，增强Nrf2的活化可有效减轻小鼠ALI的损伤程度。本研究中，Gal-1预处理有效增强了ALI大鼠Nrf2表达，并同时显著提高了Nrf2下游基因HO-1和NQO-1表达，提示Gal-1可通过Nfr2通路改善ALI大鼠的氧化应激状态。

AMPK是由三条肽链组成的丝/苏氨酸蛋白激酶，是人体能量代谢的重要调控剂，与促进分解代谢、抑制合成代谢、改善内皮功能、减轻炎症反应和抑制氧化还原反应等多项功能密切相关[19]。已有研究[20]表明，AMPK可通过磷酸化等方式激活Nrf2，使其活化并生成下游抗氧化基因如HO-1、NQO-1等，以发挥抗氧化应激的作用。本研究结果显示，高氧+Gal-1组pAMPK/AMPK高于对照组和高氧组，提示Gal-1预处理可显著增加肺组织中AMPK的磷酸化；而采用AMPK抑制剂Com C预处理后发现，高氧+Gal-1+Com C组大鼠Nrf2蛋白的表达水平显著低于高氧+Gal-1组，证实了AMPK与Nrf2之间的关联。

综上所述，Gal-1可通过激活AMPK磷酸化增强Nfr2通路，抑制炎症反应和减少氧化应激，从而改善高氧诱导的ALI。Gal-1可能成为治疗ALI的候选药物。