儿童Rotor综合征临床特点及SLCO1B1和SLCO1B3基因突变分析

叶家卫 谭丽梅 杨峰霞 徐 翼 李旭芳

广州市妇女儿童医疗中心感染性疾病科(广州 510120)

Rotor综合征(Rotor syndrome，RS，MIM #237450)，是一种遗传性非溶血性高胆红素血症，临床上较为罕见，最先于1948年由Rotor报道, 属于常染色体隐性遗传性疾病[1]，其主要临床特征是可为慢性持续性或间歇性黄疸，有时巩膜黄疸可能为唯一的临床表现，血清结合胆红素轻度升高，也可伴有间接胆红素的升高。近年来由于基因检测技术的进步，越来越多儿科患儿得以早期明确诊断。本文通过2018年—2019年广州市妇女儿童医疗中心经基因检测确诊的3例RS患者，探讨该病临床及基因变异特征。

1 资料与方法

1.1 病例资料

例1，女，5岁11月。因“巩膜黄染1月余”就诊。大便黄色，小便色黄清亮。未予特殊治疗。足月顺产，生后无明显皮肤黄染消退延迟等情况，其兄长健康，无家族史。查体：神志清，精神好，巩膜略黄染，皮肤无明显黄染。腹软，肝肋下2 cm，质软，脾未及。外院检查肝炎全套、铜蓝蛋白、自身免疫性肝炎抗体、血浆氨基酸、血酰基肉碱及尿液GC/MS均正常，EB病毒抗体及G-6-PD阴性。我院检查：HGB 122 g/L，Ret 0.12%，ALT 12 U/L，AST 30 U/L，ALP 295 U/L，GGT 9 U/L，TBIL 47.5 μmol/L，DBIL 34.8 μmol/L，IBIL 12.7 μmol/L，TBA 9.8 μmol/L，腹部B超肝脾不大。

例2，男，3岁4月。因“反复皮肤巩膜黄染3年余”就诊。患儿出生后数天出现皮肤巩膜黄染，排3天墨绿色胎便后转为淡黄色大便，小便色黄色清亮。当地医院予蓝光照射治疗后皮肤巩膜黄染明显减轻，大便转为黄色后出院。其后仍有皮肤巩膜轻度黄染，但未再诊治。10月龄感冒当地输液(用药不详)治疗后皮肤巩膜黄染较前明显，当地医院就诊检查ALT 9.05 U/L，AST 26.45 U/L，TBIL 82.99 μmol/L，DBIL 50.64 μmol/L，IBIL 32.35 μmol/L，血氨正常，予优思弗、消炎利胆片治疗后，皮肤巩膜黄染较前减轻。其后仍有反复，皮肤巩膜黄染一直未完全消退。感冒时有加重，间断口服中药退黄治疗。其兄长体健，无家族史。查体：神志清，精神好，皮肤巩膜轻度黄染，腹软，肝脾未及。我院检查：HGB 123 g/L，Ret 0.15%，ALT 9 U/L，AST 30 U/L，ALP 286 U/L，GGT 10 U/L，TBIL 47.6 μmol/L，DBIL 32.0 μmol/L，IBIL 15.6 μmol/L，TBA 3.5 μmol/L。肝炎全套、输血前四项、EBV抗体阴性。G-6-PD正常。腹部B超未见明显异常。

例3，男，2月。因“反复皮肤巩膜黄染2月”就诊。患儿生后1周出现皮肤黄染，曾服用茵栀黄，黄疸反复，大便黄色，否认解陶土色大便，小便黄色。父亲乙肝携带者，无家族史。查体：神清，精神好，皮肤巩膜轻度黄染，腹平软，肝肋下2 cm，质软，脾肋下未及。外院检查：乙肝阴性，G-6-PD正常，腹部B超未见异常。我院检查：HGB 130 g/L，Ret 0.32%，ALT 21 U/L，AST 41 U/L，ALP 385 U/L，GGT 11 U/L，TBIL 51.8 μmol/L，DBIL 36.7 μmol/L，IBIL 15.1 μmol/L，TBA 9.5 μmol/L，CMV抗体、CMV-DNA定量阴性、血浆氨基酸、血酰基肉碱及尿液GC/MS均正常。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 例1、例2采集患儿及其父母兄长，例3采集患儿及其父母外周静脉血2 mL，应用TIANamp Genomic DNA提取试剂盒(北京)提取DNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 常见肝脏遗传代谢性疾病二代测序筛查 委托武汉康圣达医学检验所进行常见已知肝脏单基因遗传性疾病二代测序筛查。

1.2.3 一代测序验证与DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定通过Illumina HiSeq平台对患儿基因组进行全外显子测序，采用IDT xGen Exome Research Panel v1.0试剂盒，Kappa文库构建试剂盒，外显子组测序目标区域平均测序深度大于100 ，目标序列的95%测序深度达20 。使用基因检测智能操作系统进行注释，SNPEFF软件(hg19，GRCh37)进行变异解读。在需要进行大片段突变鉴定时，采用DNA琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结 果

2.1 二代测序结果

3例患儿均在染色体位置chr12:21375289处SLCO1B1基因出现c.1738C>T纯合突变(见图1)；均在SLCO1B3基因5号内含子区域存在大片段插入纯合突变(6.1-kbp L1 retrotransposon in intron 5)。

2.2 一代测序验证

对SLCO1B1基因突变位点进行家系验证，例1患儿父亲、母亲为杂合突变，兄长为野生型；例2患儿父亲、母亲、兄长均为杂合突变；例3患儿父亲、母亲均为杂合突变(见图1)。

图1 例1(A)、例2(B)、例3(C)患儿SLCO1B1基因突变位点测序图

2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳进行大片段突变鉴定

为鉴定SLCO1B3基因的5号内含子区域的大片段插入突变，在突变体的插入片段前端设计引物F为“TCAATGGAACATCACCTGAGA”、在插入片段上设计引物R1为“CCGTTTCTTAAGCCGGTCTG”、在插入片段后设计引物R2为“GTGGTGGGTTTCTCCTTCTG”，位置见图2，其中A为突变体、B为野生型。根据DNA琼脂糖凝胶电泳结果是否存在条带以及扩增序列大小的情况来判断突变类型。结果提示SLCO1B3基因5号内含子区域大片段插入突变例1患儿父亲、母亲为杂合突变，兄长为野生型；例2患儿父亲、母亲、兄长均为杂合突变；例3患儿父亲、母亲均为杂合突变(见图3)。

图2 引物设计示意图

图3 SLCO1B3基因5号内含子区域存在大片段插入突变

2.4 诊断

根据3例患儿临床主要表现为巩膜和(或)皮肤黄染，实验室检查示以高直接胆红素血症为主，或伴间接胆红素增高，肝功能转氨酶正常，γ谷氨酰转肽酶和碱性磷酸酶及胆汁酸水平正常，血色素、网织红细胞未见异常，无胆道梗阻征象，考虑高结合胆红素血症。根据SLC01B1和 SLC01B3双基因纯合突变结果，确诊为Rotor综合征。

3 讨 论

肝脏是胆红素代谢的唯一器官。以往我们所认知的肝脏清除胆红素的过程包括四个主要步骤:肝细胞摄取和储存未结合胆红素；未结合胆红素与葡萄糖醛酸转移酶在滑面内质网结合转变为结合胆红素；结合胆红素排泄入胆汁;肝细胞再摄取结合胆红素[1]。近几十年来，对胆红素代谢的理解已经随着胆汁中内源性和外源性阴离子底物的消除过程而得以扩展[2]。结合胆红素排泄入胆汁的过程中，其中一部分可向肝细胞胆小管面弥散，另一部分向肝细胞血窦面弥散。在肝细胞胆小管面，结合胆红素可通过ABCC2/MRP2和ABCG2/BCRP转运蛋白被有效分泌入胆汁[3]。而弥散至肝细胞血窦膜面的结合胆红素由MRP3蛋白转运分泌入血液，随后可再被窦膜上结合的有机阴离子转运蛋白OATP1B1和OATP1B3摄入肝细胞[1]。

近年来的研究认为位于12号染色体上的相邻基因SLCO1B1和SLCO1B3均存在纯合或复合杂合突变且其编码的OATP1B1和OATP1B3蛋白同时完全缺失是RS发生的分子机制，为常染色体双基因隐性突变的遗传性疾病[4]。OATP1B1和OATP1B3均在肝细胞膜表达，为溶质载体超家族有机阴离子转运多肽，主要介导血液中各种内源性和外源性化合物在肝细胞的吸收[3]。胆红素是SLCO1B1/OATP1B1和SLCO1B3/OATP1B3的底物[5]。RS患者的肝组织免疫组化染色进一步证实OATP1B1和OATP1B3两种转运蛋白均完全缺失，而单一等位基因上表达的SLCO1B1或SLCO1B3均不会出现黄疸。这种双基因同时突变使得肝细胞对血液中的结合胆红素的再摄取出现障碍[6]，且OATP1B1和OATP1B3蛋白的表达在位于中央静脉附近的肝细胞较门管区附近肝细胞中更高，可能与胆汁分泌的调节饱和能力有关。本研究中3例患儿均出现了SLCO1B1基因的c.1738C>T突变，文献报道的此处突变可以造成蛋白功能缺失[7]。SLCO1B3基因中发生的大片段插入突变虽暂未有文献收录或报道，但其大片段的插入突变容易引起移码突变而造成编码蛋白功能丧失，结合本研究中3例患儿的临床及血生化特征，排除溶血性及胆道梗阻性疾病后，诊断RS。

以往认为RS最初出现黄疸的年龄多为11～19岁[8]，但本研究中3例患儿起病年龄早，尤其是例2、例3患儿出生后不久即开始出现反复黄疸，从发现症状至确诊的时间平均15.67个月，最短为4个月，最长为38个月。除黄疸外，查体无特异性发现，3例患儿生长发育正常，无明确家族史。血清胆红素升高，以结合胆红素增高为主，转氨酶正常。新生儿SLCO1B1/OATP1B1和SLCO1B3/OATP1B3 mRNA的表达比成人低约500倍，12个月以下婴儿比成人低100倍，因此，新生儿和婴儿结合胆红素的摄取、结合和排泄相关的转运蛋白和酶的表达和活性均显著降低[9]，发病年龄也可在新生儿期和婴幼儿期。大多数的研究表明，OATPs是结合胆红素的主要转运蛋白[5]。但是，全基因组关联分析表明，SLCO1B1/OATP1B1或SLCO1B3/OATP1B3活性降低的多态性与血清结合和非结合胆红素的升高均有一定的相关性[4]，也就是说OATPs在肝细胞内对未结合胆红素的初始摄取中也发挥了作用。因此，部分患者可表现为结合和非结合胆红素均有升高。本研究中例2患儿就有结合胆红素和非结合胆红素均升高的情况发生。

肝组织无明显的结构或细胞形态学异常，也无色素沉着，因此以往RS主要通过肝脏病理学检查与Dubin Johnson综合征相鉴别。通过基因检测技术，本研究中3例患儿避免了创伤性肝脏病理学检查并提高了幼龄儿童的早期诊断率。RS的胆红素代谢障碍是从血浆到肝脏转运水平的异常，而不是像Dubin-Johnson综合征是肝细胞分泌胆红素至胆小管途径的紊乱[1-2]。

RS是良性的，不需要任何治疗。但应注意OATP1B蛋白还负责一些内源性或外源性化合物及药物的清除[1]，作为一种药物转运蛋白对药物代谢动力学也具有影响，尤其是常用药物如青霉素类，还有其他如他汀类药物、利福平、甲氨蝶呤等药物。SLCO1B基因的任一有害突变,即使没有RS的临床表现,也可能会出现药物使用毒性风险增加。本研究中例2患儿在应用感冒药物后出现黄疸加重是否与OATP1B蛋白对药物代谢的影响有关，目前尚不清楚。

因此，临床上对于儿童出现反复或持续的原因不明的高结合胆红素血症，又无明显肝细胞损害的情况时，应考虑到此病的可能。结合患儿临床特征，选择合适的检查手段，及早行基因检测，以明确病因，从而减少误诊的发生，避免过度治疗。