草丁膦乙酰转移酶基因序列分析

刘倩琪 王学林

（广东省深圳市农业科技促进中心，广东 深圳 518000）

bar基因来源于土壤吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus），具有良好的抗草丁膦除草剂的性能，多用作转基因植物的选择标记。据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）公布，油菜、棉花、菊苣、玉米、水稻、大豆等6种植物58个品系以bar作为筛选标记基因。

我国在转基因植物研发、选育、鉴定过程中，常把bar基因作为转基因成分检测的重要靶标元件。

研发机构因研究材料差异而选择不同的bar基因或者改造bar基因作为分子标记，国标、行标中bar基因则规定检测175 bp和262 bp两个片段，显然无法满足bar基因多样性的要求；检测出与目的片段大小不一致的特异性电泳条带，按照标准判定为阴性，可能会造成漏检；普通的凝胶电泳分辨率较低，亦无法判断待测样外源基因序列是否与标准提供的序列一致，从而导致目的片段差异较小或序列内部存在差异时，难以判定。

本文针对检测工作中发现的水稻和小麦两个待测样中与目标序列不同的特异性bar基因片段，采用PCR产物测序法进行序列比对分析，发现水稻和小麦待测样品的bar基因尽管上下游引物序列相同，内部基因序列差异较大，相似度低，说明测序技术能够更精准地判定待测样阴阳性，该研究转基因成分检测及其标准修订具有重要的参考意义。

1.材料与方法

1.1 材料

水稻种子由上级主管部门的市场监督抽查任务所获得，小麦样品为某品牌在售干面条；标准对照样品为检测bar基因的MS1。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制备

取100 g水稻样品种子于粉碎机粉碎后取研磨杯杯壁细粉100 mg分装至离心管备用；小麦样品取100g样品折碎后于粉碎机粉碎，同样取研磨杯杯壁细粉100 mg分装至离心管备用；标准样品直接取样100 mg分装至离心管，采用DNeasy Plant Mini Kit试剂盒，按照其操作手册，提取样品DNA，经超微量核酸蛋白分析仪测定DNA浓度及纯度，后调整浓度至50 ng/μl，-20℃冷藏保存备用。

1.2.2 引物及序列

根据现行《转基因植物及其产品成分检测bar或pat基因定性PCR方法》（农业部1782-6-2012号公告）公布的bar基因引物序列（bar-F:5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3’，bar-R:5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'），分别合成bar基因的上下游引物。bar基因标准序列如下：

1.2.3 PCR扩增及PCR产物检测

DNA模板2μl、5μl Taq聚合酶、上下游引物各0.2μl，加水2.6μl定容至10μl反应体系。PCR反应程序：94℃10s；94℃ 5s，60℃ 34s，35 cycles；10℃ ∞。PCR 产物用2% 浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.2.4 序列分析

待测样和对照样bar基因的PCR扩增产物由华大基因公司进行双向测序，重复2次，测定的上下游序列采用MEGA3.1 软件进行分析和拼接。

2.结果与分析

2.1 琼脂糖电泳凝胶结果分析

根据《转基因植物及其产品成分检测bar或pat基因定性PCR方法》（农业部1782-6-2012号公告）公布的bar基因目的片段大小为262 bp，经凝胶电泳检测（见图2）。与参照样品的PCR产物片段大小相比，待测样1的目标条带偏小，约为240 bp；待测样2的目标条带偏大，约为500 bp。由于凝胶电泳检测法分辨率较低，只能检测出bp值区间段而不能准确识别具体bp值，为了确定准确bp值，对PCR产物进行目标序列测序。

注：M为DL-2000Marker,1为待测样品1，2为待测样品2，CK+为阳性参照，CK-为空白对照

2.2 目标序列测序结果

利用MEGA 3.1软件对上下游测序结果进行分析。下游序列反转后，与上游序列比对，剔除序列两端不可靠碱基位点，搜寻出上下游引物位置及中间重叠区域，将序列拼接完整。测序结果显示目标序列的个别位点存在套峰现象（见图2），待测样1在bar基因上游序列的第113个碱基存在G碱基中嵌套A碱基，下游序列反转后确定该处碱基为G；待测样2在多个位点存在套峰，不影响峰图判定。

2.3 序列拼接结果

经MEGA3.1 软件分析，上游序列末端比对出下游引物序列bar-R: bar-R:5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'（见图3），下游序列反转后，在起始端比对出上游引物序列bar-F:5’-GAAGGCACGCAACGCC-3’，上下游序列拼接结果发现待测样1的bar基因序列为236 bp（见图3 ），比检测标准中的提供的标准序列小26 bp；待测样2的bar基因序列为486 bp（见图4），比标准中的序列片段大224 bp。

图3 bar基因PCR产物上下游序列（图示部分序列）

图4 水稻待测样1 bar序列拼接结果（阴影示上下游引物位置）

2.4 序列比对分析

经过序列比对分析发现，待测样1和2的bar基因序列与标准提供的序列尽管上下游引物序列相同，但内部序列与标准序列均不同（见图5）。待测样1的bar基因序列在第37、42～45、102、110～ 113、131～ 132、159～169、216、228～231等26个位点发生碱基缺失，内部序列存在103个碱基不同，仅133个碱基相同，序列相似度仅为50.76%。

图5 小麦待测样2 bar序列拼接结果（阴影示上下游引物位置）

农业部1782-6-2012号公告提供的262 bp的bar基因序列与美国国家生物信息中心(NCBI)数据库的序列进行比对分析，发现该序列在已知的转基因玉米Bt176品系、克隆载体pbar-35S和pSAT1A-ocsAocsP-bar-ocsT均存在100%的同源序列。待测样1的bar序列有129个碱基与土壤中的鞘氨醇胞菌BN140058亚种存在73%相似度，但上下游引物均不匹配。待测样2的bar序列有254个碱基与野生二粒小麦在LOC119283572存在71%非典型相似度，且上下游引物均不匹配（见图7）。测序结果表明待测样1和2可能分别来源于鞘氨醇胞菌和野生小麦，尽管PCR扩增出特异性片段，片段大小与目的序列不一致，测序结果与标准序列差异较大，与现有已知序列相似度低，故不能判定2个待测样的bar基因为转基因阳性。

图6 水稻待测样1与bar基因标准序列比对结果（★示碱基位点相同）

图7 小麦待测样2 bar 序列与NCBI网站序列比对结果

3.结论与讨论

农业部1782-6-2012号公告提供的序列为262 bp，国标GB/T 19495.4-2018提供的bar基因片段大小为175 bp，在NCBI数据库中存在多个同源序列。待测样水稻中的 bar基因序列比已知序列小26 bp，可能来源于土壤中的鞘氨醇胞菌；待测样小麦中的 bar基因序列比已知序列大223 bp，可能来源于野生小麦；待测样水稻中的 bar基因序列与已知序列同源性仅50.76%，待测样小麦中的 bar基因序列与标准序列几乎无同源性，该两个样品的bar基因检测结果应判定为阴性。

标准选择的175 bp和262 bp是bar基因的骨干序列，但bar基因的完整需要远大于262 bp。我国2008年启动转基因重大专项以来，已经十多年，国内研究转基因水稻、小麦、油菜等作物的科研机构较多。bar基因是常用的植物转基因的选择标记，各研发单位采用的bar基因偏差段大小从100多bp到500 多bp都有，因此该基因序列极有可能是存在经过基因改造的新的外源片段，在检测工作中应予以重视，必要时应辅助其它外源基因或测序加以判定。在转基因成分鉴定的标准修订时，应针对与目标片段大小不一致的特异性电泳条带，考虑采用测序、酶切等方法加以佐证，以防漏检或误检。