体外法估测常用饲料原料内源代谢葡萄糖值

■姜宇翔 郑自彬 吕良康 冯 志 李 强 张 慧 任 莹，2 赵胜军，2*

（1.武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，湖北武汉 430023；2.动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，湖北武汉 430023）

代谢葡萄糖（MG）由卢德勋先生在1996 年首次提出，指日粮中经动物机体消化、吸收过后，可以提供给动物本身用于代谢的葡萄糖总量[1]。MG 分为外源代谢葡萄糖（IDSG）和内源代谢葡萄糖（LFAG）。IDSG指饲粮中淀粉即碳水化合物在小肠消化酶作用下分解成的葡萄糖，LFAG 指饲粮经过小肠后未被吸收的营养物质在大肠中被微生物分解产生的挥发性脂肪酸（VFAs）被机体吸收后通过糖异生等作用产生的葡萄糖[2-3]。前期关于MG 的研究大多集中于反刍动物身上，我国目前关于猪MG的研究仍处于起步阶段。赵胜军[4]在2014年建立了猪MG计算公式，方勇[5]通过回肠瘘管技术对断奶仔猪IDSG 进行测定，张丹丹[6]通过血瘘管技术结合动静脉浓度差法建立了日粮LFAG的体内测定方法。

挥发性脂肪酸（VFAs）包含乙酸、丙酸、丁酸以及其异构体等，其特点是具有较强的挥发性[7]。在反刍动物中，瘤胃发酵日粮纤维所产生的VFAs 可提供能量需求的70%～80%[8]。在单胃动物中，后肠微生物发酵所产生的VFAs 可占生长猪能量需求的5%～30%[9]。其中发酵产生的丙酸被肠壁吸收后，小部分会转化为乳酸，其余部分吸收到肝脏被转化为葡萄糖。乙酸被吸收后转化为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A是糖代谢、脂质代谢和蛋白质代谢的重要中间产物[10]。丁酸的产生可直接为肠道细胞提供能量，并促进猪体肠道健康[11]。可见，肠道发酵产生的VFAs 在猪营养物质代谢和生长发育过程中起着至关重要的作用，是不可被忽略的[12]。因此，如何定量测定机体VFAs 净吸收量就显得尤为重要。

肠道产生的VFAs，除了少量随粪便排出体外以外，大部分会被肠壁细胞吸收利用或通过门静脉进入肝脏被转化和利用。由于VFAs 代谢和吸收的复杂性，定量测定VFAs的净吸收量，需要给试验动物安装血管瘘，并采用同位素示踪法、动静脉浓度差法和屠宰法综合测定，不仅过程繁琐，技术难度也非常大。体外法不仅简便、快捷，可避免繁琐的动物试验，而且还可以测定单一原料的VFAs 产生量，所以更适用于推广和应用。为此，本研究拟用体外法来测定日粮丙酸和乳酸的产生量，并与前期体内法的结果相结合，建立回归关系，最终建立日粮LFAG 的体外估测方法，并测定常用饲料原料LFAG值，为MG作为营养评价新指标奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验日粮

根据NRC（2012）和中国饲养标准配制等氮和纤维水平分别为3.00%、4.50%和6.00%的3 种日粮。其组成及营养水平见表1。

表1 日粮组成和营养水平(%)

1.2 主要仪器

恒温摇床（上海知楚仪器有限公司，ZHSY-50）、100 mL三角瓶、微型粉碎机、电子分析天平。

1.3 试验设计

将3 组日粮及4 种饲料原料进行粉碎过筛（分析筛：孔径0.42 mm）作为底物，具体见表1、表2。体外进行模拟“胃-小肠消化”，收集残渣并烘干粉碎，进行体外发酵产气，同时测得丙酸及乳酸产生量，通过与前期体内法研究[10]所得的大肠丙酸净吸收量、乳酸门静脉净吸收量进行回归分析，具体为3种日粮对应生长猪大肠丙酸净吸收量为（15.21±2.55）、（13.33±2.23）g/d和（8.13±1.63）g/d，生长猪大肠乳酸净吸收量为（7.57±2.60）、（3.17±1.25）g/d 和（12.04±1.81）g/d。根据它们的相关性系数得到体外测定日粮LFAG的方法，进而通过此方法测定几种常用饲料原料中MG值。

参照方勇[5]模拟“胃-小肠消化”，其中胃消化阶段在胃蛋白酶作用下40 ℃恒温摇床中消化1 h。在小肠阶段在胰蛋白酶作用下40 ℃恒温摇床中消化6 h。参照Williams等[13]的方法进行体外产气法研究，大概步骤为收集“胃-小肠消化”后的残渣制备发酵底物，采集6～8头30 kg左右猪的新鲜粪样制备发酵菌源，称取0.5 g底物、10 mL菌源和164 mL培养基于200 mL发酵瓶中，同时冲入CO2形成厌氧环境。在恒温摇床39 ℃条件下振荡培养48 h，每组日粮5个重复，1个对照。收集24、36 h和48 h上清液，测定丙酸和乳酸产生量。

1.4 测定指标及计算方法

参照桂黎凤等[14]的方法测定发酵过程中丙酸产生量，参照郭子好等[15]测定发酵过程中乳酸产生量。参照赵胜军等[4]提出的猪日粮中常见饲料原料LFAG计算公式：

式中：LFAG——内源代谢葡萄糖；

Pr——大肠发酵产生的丙酸量（mmol/d）；

La——大肠发酵产生的乳酸量（mmol/d）；

K2和K3——分别为丙酸和乳酸的吸收率；

0.83 和0.87——分别为丙酸和乳酸与葡萄糖的能值之比。

1.5 数据统计

数据用SPSS 23.0 统计软件进行统计分析，采用“平均数±标准差（Mean±SD）”表示，单因素方差分析进行显著性检验，采用Duncan’s 多重比较，使用SPSS 23.0统计软件设计回归方程。

2 结果与分析

2.1 不同时间段体外发酵丙酸产生量与体内大肠吸收量回归分析（见表3、图1）

表3 不同时间体外发酵丙酸产生量与体内大肠丙酸吸收量回归分析

图1 48 h体外发酵丙酸产生量与体内大肠丙酸吸收量回归分析散点图

由表3和图1可知，随发酵时间增长，丙酸产生量也不断增加，在36 h 时，日粮Ⅰ组丙酸产生量显著高于日粮Ⅲ组（P＜0.05），在48 h 时，日粮Ⅰ组丙酸产生量显著高于日粮Ⅲ组（P＜0.05），而日粮Ⅰ组和日粮Ⅱ组间丙酸产生量无明显差异。同时日粮Ⅰ组丙酸产生量在3个时间段均为最高，且随着纤维水平的上升，丙酸产生量呈下降趋势。通过体外发酵产生的丙酸与体内大肠丙酸吸收量回归分析发现，在48 h两者关系达到最佳（R2=0.968 3）。

2.2 不同时间段体外发酵乳酸产生量与体内门静脉吸收量回归分析（见表4、图2）

图2 48 h体外发酵乳酸产生量与体内门静脉乳酸吸收量回归分析散点图

表4 不同时间体外发酵乳酸产生量与体内乳酸门静脉净吸收量回归分析

由表4和图2可知，与丙酸产生量不同的是，乳酸产生量较少，且只有在24 h 时，日粮Ⅱ组与Ⅲ组乳酸产生量差异显著（P＜0.05），其余时间点，3个组间并无显著差异（P＞0.05）。同时日粮Ⅲ组乳酸产生量在3个时间段均为最高，且随着纤维水平的上升，乳酸产生量呈上升趋势。同时通过体外发酵产生的乳酸与体内门静脉乳酸吸收量作回归分析发现，在48 h两者关系达到最近（R2=0.992 5）。

2.3 4种常用饲料原料LFAG值（见表5）

4 种常用饲料原料体外发酵后丙酸（Y1）和乳酸（Y2）的产生量如表5 所示，将其代入线性方程Y1=3.826 8X1-6.832 9（R2=0.968 3）和Y2=0134 1X2+3.445 0（R2=0.992 5）后根据最佳发酵时间（48 h）进行单位换算，并代入LFAG 测定公式中，得到玉米、豆粕、大豆皮、小麦麸LFAG 值分别为177.55、32.83、76.02 g/kg 和14.83 g/kg。由此可知玉米和大豆皮LFAG 值相对较高，豆粕和小麦麸LFAG 值相对较低。

表5 4种常用饲料原料体外发酵丙酸和乳酸产生量及内源代谢葡萄糖值

3 讨论

葡萄糖作为机体生命活动中最主要的能源物质，在维持机体自身新陈代谢中起着非常重要的作用[16-17]。单胃动物中，VFAs 占生长猪维持能量需要的5%～30%[17]。MG 的提出将饲粮组分和葡萄糖的产生量建立起直接联系[19]，LFAG 作为MG 的组成部分，将体内葡萄糖需要量与大肠发酵所产生VFAs 相联系起来，有利于达到对机体能量精细化调控的目的。由此可认为，丙酸和乳酸的产生量即为影响LFAG 的主要因素。饲粮中经动物大肠发酵产生的VFAs（丙酸和乳酸），通过糖异生转化而成的葡萄糖，即为本试验的估测指标LFAG。

本试验通过体外发酵产气法测定3 组日粮丙酸和乳酸产生量，结果表明在同一时间段内，3组日粮的丙酸产生量呈下降趋势，乳酸的产生量呈上升趋势，该趋势是由于3组日粮的纤维水平较低、淀粉水平较高所导致。随着发酵时间的增长，3 组日粮丙酸和乳酸的产生量呈上升趋势。当发酵时间为48 h，其与体内法研究所得数据线性回归拟合度最高（丙酸，R2=0.968 3；乳酸，R2=0.992 5）。因此，通过它们的线性关系可以达到体外法估测日粮LFAG 的目的。本试验利用该方法通过线性回归方程进一步计算出4 种饲料原料玉米、豆粕、大豆皮和小麦麸LFAG 值，分别为177.55、32.83、76.02 g/kg和14.83 g/kg。该方法与李强等[19]通过体外法建立淀粉降解率的线性回归方程，估测饲粮IDSG所用到的方法相似，均具有简便性及精确性。但不同原料丙酸和乳酸产生量相差较大，因此有关于原料间的组合效应还有待于更深入的研究。

总而言之，MG 作为一种新的饲粮营养价值评价指标，在能量代谢与物质代谢之间建立了直接联系，有利于通过对物质的供给控制达到对机体能量精细化调控的目的。而体外法测定LFAG方法的建立，对MG饲料数据库的完善提供了有效手段，具有重大的意义。

4 结论

体外法可作为日粮LFAG水平的体外估测方法。

体外法发酵时间48 h 时，回归方程拟合度最佳。丙酸产生量线性回归方程为Y1=3.826 8X1-6.832 9，R2=0.968 3；乳酸产生量回归方程为Y2=0.134 1X2+3.445 0，R2=0.992 5。

③测得4种常用饲料原料玉米、豆粕、大豆皮、小麦麸LFAG 含量分别为177.55、32.83、76.02 g/kg 和14.83 g/kg。