PBS在鼠疫血清学诊断中的作用及质控措施

冯建萍，郭文涛，吴海生，魏绍振

(青海省地方病预防控制所 国家卫生健康委鼠疫防治研究重点实验室，西宁 811602)

鼠疫是严重危害人类和其他动物生命和健康的烈性传染病，也是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病[1]。鼠疫的判定，特别是初次判定，以及鼠疫流行病学分析，都需要鼠疫细菌学做出正确诊断[2]。仅靠分离鼠疫菌的方法对鼠疫病人诊断、进行病毒原学检索、动物鼠疫调查已不能解决问题[3]。1952年Baker提取了特异的鼠疫F1Ag及特异性抗体的获取成功，鼠疫间接血凝技术在鼠疫监测、鼠疫诊断和追溯诊断中，具有简便易行、敏感特异和较为经济等特点[4]。间接血凝试验与50年代初由Amies最先引入鼠疫领域，1956年被WHO推荐为鼠疫诊断常规方法之一，70年代初，该试验已在我国得到推广，并大规模用于实践[5]。检查抗原的反向血凝试验(RIHA)在70年代已陆续问世，目前已在国内广泛应用[5，6]。在该实验试剂制备过程中，绵羊红血球与F1Ab结合需要一个适宜的pH及渗透压环境。为此，磷酸盐缓冲液(以下简称PBS)的制备质量尤显重要。因此我们对不同批次的PBS按其F1Ab绵羊红血球操作流程进行制备，对其结果进行评价，为鼠疫菌的诊断提供标准、可靠的F1Ab绵羊红血球，确保鼠疫检测工作顺利开展。

1 血清学反应在鼠疫诊断中的应用

通过对各种被检材料进行血清抗体检查或抗原检查，鼠疫血清学方法已在鼠疫监测和临床诊断及科学研究方面得到广泛应用。它可用于：检查血清中鼠疫菌抗体；检查材料中的鼠疫菌抗原。在鼠疫血清学检验中又分为鼠疫间接血凝试验(RHA)和鼠疫反向间接血凝试验(RIHA)。经过50多年的广泛应用，间接血凝试验已经成为鼠疫血清学实验的金标准。反向间接血凝试验与间接血凝试验一样也是诊断鼠疫的常规方法之一。它具有快速、敏感、特异、操作简便，对腐败材料及干枯材料的检测优于细菌培养，因此在疑似鼠疫尸体材料的诊断中起着重要作用[1]。在血清学反应中，诊断试剂制备的各环节又显得极为重要。

1.1 F1Ab绵羊红血球在鼠疫血清学诊断试剂中的作用

鼠疫F1Ab绵羊红血球是反向间接血球凝集试验的前提与基础，它是用F1Ab致敏血球检查鼠疫特异性抗原的血清学方法。可用于：检查鼠疫菌(活菌、死菌)和可溶性抗原；检查污染和腐败材料中鼠疫菌抗原物质；鼠疫患者和尸体的诊断；鼠疫动物病的监测；鼠疫菌种的鉴定；检查待测菌中是否有鼠疫F1Ag；鼠疫疫源地调查[7]。

1.2 磷酸盐缓冲盐水在制备F1Ab绵羊红血球中的作用

磷酸盐缓冲盐水一般有活性的生物制剂都要用它来稀释，原因就是它具有盐平衡，可调整适宜pH的缓冲作用，蒸馏水不具有盐平衡作用，可破坏生物蛋白的结构及生物特性，生理盐水不具有调整pH的作用，对完整的，具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS是首选。它可维持体系的稳定：保持pH的稳定；保持溶液的总离子强度稳定；保证溶液内容物质的稳定，如一般酶反应都要在缓冲液中进行。鼠疫F1Ab致敏血球是间接血凝试验的前提，鼠疫间接血凝技术在鼠疫监测、鼠疫诊断和追溯诊断中，具有简便易行、敏感特异和较为经济等特点。WHO(1956)将此方法在国内得到推广，并大规模用于实践[8]。在该试验试剂的制备过程中，绵羊红血球与F1Ab的结合需要一个适宜的pH及渗透压环境，为此PBS的制备质量尤显重要。

2 不同批次的磷酸盐缓冲液对鼠疫F1Ab绵羊红血球制备的效果评价

鼠疫F1Ab绵羊红血球用的pH6.4的PBS将鼠疫F1Ab液与1%单宁酸血球悬液混合，置37℃水浴中作用15min～30min，再用0.9%生理盐水洗3～4次，最后用1%健康兔血清盐水洗1次，测定效价，并用该液配成10%血球悬液，(含0.1%NaN3防腐)分装，放置冰箱备用[7]。pH6.4的PBS的制备按鼠疫防治制作流程进行配制[9]。并对2019年和2020年两个不同的时间段制备的PBS分别稀释F1Ab致敏血球至最适浓度(50μg/mL-100μg/mL)，采用试管法用盐水从1亿个菌/mL稀释至1.5万个菌，观察不同批次PBS对其测定效价的影响，从结果中发现，2019年和2020年PBS对制备的鼠疫F1Ab绵羊红血球其测定效价为：从1千个菌/mL至25个菌/mL，其效价均为(#)；浓度为12.5万个菌/mL时，2019年制备的PBS对鼠疫绵羊红细胞测定的效价为(+++)，2020年制备的PBS为(#)；6.25万个菌/mL时，2019年和2020年的PBS对制备的绵羊红血球其效价为(+++)；浓度为3.125万个菌/mL时，2019年和2020的PBS对其制备的鼠疫F1Ab绵羊红血球测定其效价为(++)；1.5万个菌/mL时，保存一年和现场制备的PBS对鼠疫F1Ab绵羊红血球其测定效价均为(-)。其中阳性对照为(+)，空白对照为(-)。从结果中可看出2019年和2020年的PBS对其制备的鼠疫F1Ab绵羊红血球的浓度均达到3万个菌/mL(可达到F1Ab诊断试剂盒5万个菌/mL的诊断标准)。从上述结果说明不同批次(保存一年和现场制备)的PBS对制备的鼠疫F1Ab绵羊红血球测定结果无影响。

3 讨论

鼠疫F1Ab致敏血球(简称F1Ab血球)是鼠疫反向血凝试验的基础，具有很强的敏感性，鼠疫F1Ab致敏血球是血凝反向药盒的关键试剂[10]。反向间接血球凝集试验是将鼠疫特异性抗体致敏到经单宁酸处理的绵羊红细胞上，以检查鼠疫特异性抗原的血清学方法。抗体致敏血球较稳定，且可以通过抑制实验排除非特异性凝集[1]。在该试验试剂的制备中，绵羊红血球F1Ab的结合，需要一个适宜pH及渗透压环境，为此PBS的制备质量尤显重要。PBS可调整适宜pH缓冲作用，保存pH的稳定及溶液的总离子强度稳定，保证溶液内容物质的稳定。那么不同保存期的PBS对制备的鼠疫F1Ab绵羊红血球测定结果有何影响，还未曾有过报道。为此我们对2019年和2020年的PBS制备的绵羊红血球，采用试管法，用盐水从1亿个菌/mL稀释至1.5万个菌/mL，测定其效价，从结果中发现不同批次的PBS对制备的鼠疫F1Ab绵羊红血球滴度均达到3万个菌/mL(可达到F1Ab诊断试剂盒5万个菌/mL的诊断标准)。由此说明：不同批次(保存一年和现场制备)的PBS对制备的鼠疫F1Ab绵羊红血球测定结果无影响。(说明对其鼠疫F1Ab绵羊红血球的敏感性不受影响，浓度均达到3万个菌/mL，被检菌液稀释度越低，仍能检测出阳性结果，说明该试剂敏感性好。)至于PBS长期保存是否对鼠疫F1Ab绵羊红细胞血球测定效价有影响，还有待于继续进行探索，从而得出相应的结论。因此，在鼠疫F1Ab致敏血球制备过程中，应注意各个环节的影响因素，严把质量关，规范其操作规程[11]，从而制备出优质的鼠疫F1Ab致敏血球是保证鼠疫反向凝集试验的基础，以确保鼠疫防控工作顺利进行，为鼠疫的快速诊断提供良好的基础保障。