金黄色葡萄球菌感染的治疗新策略—噬菌体

段怀洋,杨曜

(1.贵州省毕节市纳雍县农业农村局动物疫病预防控制中心，毕节 553300；2.贵州省毕节市纳雍县农业农村局动物卫生监督所，毕节 553300)

金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在，50%以上健康人的皮肤上都存有金黄色葡萄球菌。而且其污染食品的机会很多[1]，常见的乳以及乳制品、蛋以及蛋制品、各类熟制品都有可能污染[2]。同时金黄色葡萄球菌在临床上可以引发心内膜炎、骨髓炎、肺炎等疾病，占医院感染病例的10%[3]。对于金黄色葡萄球菌感染最主要治疗策略是抗生素，然而由于抗生素的广泛使用，导致出现大量的耐药菌株尤其是耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)[4]。因此，对于金黄色葡萄球菌的潜在危害的研究以及对它的控制成为热点。

噬菌体是一种能够感染细菌的小病毒，可以通过对细菌的吸附达到自己繁殖的目的，同时对细菌进行裂解[5]。由于其这种专门吸附细菌的特性，是一种很好的细菌杀伤武器[6]。而且据报道已经鉴定和描述的噬菌体超过6000种[7]，不难想象其作为一种丰富的资源，有待人们去挖掘。

近几年，随着细菌耐药性的不断严重，西方一些权威的研究机构和业内的专业人士开始重新审视噬菌体疗法。一些公司已经对天然的噬菌体展开了研究，如弗吉尼亚州的 Ampli Phi 生物科学中心，已经在伦敦完成了一个包含 24 人的临床研究，他们利用噬菌体疗法成功治愈了绿脓杆菌感染引起的成人中耳炎[8]； Basdew和Laing利用3株噬菌体在体外有效治疗金黄色葡萄球菌感染的奶牛乳腺炎[9]。但是人们对于噬菌体治疗的研究和了解还是有限，本文就已有的噬菌体知识进行综述，帮助更好的了解审视噬菌体。

1 噬菌体治疗的发展历史

1896年，Ernst Hankin报道了印度恒河和朱纳河流域的霍乱弧菌的一种抗菌活性。两年后，一位俄国细菌学家在研究枯草芽孢杆菌时，也描述了类似的情况。直到1915年，Frederick Twort推测病毒可能是这种抗菌活性的原因。英国细菌学家在尝试脂培养基上培养牛痘病毒时，注意到了微球菌“玻璃”菌落的生长[10]。当他在显微镜下观察这些菌落时，他注意到有退化细菌的颗粒，由此阐明了他的假设。后来法裔加拿大微生物学家Felix d’Herelle继续在噬菌体领域进行了研究，他声称观察到了“噬菌体现象”。在实验中，d’Herelle在琼脂培养基上发现了细菌菌落周围的清晰区域，后来称其为空斑。在他的发现(1919年)之后不久，其在巴黎医院 des Enfants-Malades教授的监督下，用噬菌体疗法治疗痢疾。在4例患者治疗后，噬菌体的制备证实了其疗效。然而，这些发现直到1931年才发表，这给了Richard Bruynoghe和Joseph Masin很大的启发，使得他们后来报道了噬菌体在治疗人类感染上的第一个应用[11]。他们用噬菌体治疗葡萄球菌性皮肤病。在这些重要的发现之后，微生物学家开始在动物和人类的治疗方面使用噬菌体。噬菌体治疗领域的工作开始迅速发展。D 'Herelle建立了自己的实验室，生产了第一个商业噬菌体鸡尾酒。科学家们在各种感染上试验噬菌体;一项对21例伤寒患者的研究报告显示，在使用噬菌体治疗的情况下，死亡率从15.6%下降到4.8%，并发症减少了43.2%。大量噬菌体成功治疗试验的报道开始出现，如败血症、尿路感染、手术感染、皮肤感染、腹膜炎、耳鼻喉科感染，以及沙门氏菌相关结肠炎等。噬菌体治疗热潮已经蔓延到美国，甚至著名的制药公司，如Eli Lilly、Abbott Labs和E.R.Squibb，也开始生产治疗噬菌体鸡尾酒。在磺胺类抗生素和青霉素出现后，对噬菌体治疗的兴趣消退，在1934年Eaton和Bayne-Jones 的报告中，对噬菌体治疗方案的准确性和一致性提出质疑[12]。而一些国家，如波兰、格鲁吉亚和俄罗斯，继续在噬菌体治疗领域进行研究，至今仍使用噬菌体治疗细菌感染。

2 噬菌体治疗的优点

噬菌体治疗有许多优点，使它成为一种非常有潜力的替代抗生素治疗的药品。首先，噬菌体对它们的宿主是非常特殊的，不像抗生素，它有更广泛的宿主谱，可能会导致生物失调、继发感染和其他副作用。而噬菌体只感染细菌细胞，对哺乳动物细胞没有影响，所以对宿主是没有毒性的。此外，噬菌体在自然界中普遍存在，使得新噬菌体的分离和选择相对于抗生素的发展来说是一个相对快速的过程，而抗生素的开发需要花费数百万美元以及多年的研究来开发一种有效的抗生素药物[13]。因此，与抗生素相比，噬菌体治疗的发展阶段相对便宜。耐药性的发展是抗生素治疗的一个重要问题，尽管细菌可能会对特定的噬菌体产生抗性，但总有一系列不同的噬菌体具有相同的靶点。同时，高频率的突变使得噬菌体能够与宿主共同进化，通过强大的进化压力来克服任何获得的抗性。抗生素并不总是有效的原因之一是它们被代谢并从体内排出而没有到达感染部位。噬菌体的优势在于，它们只能在宿主细菌的存在下进行复制，并在系统管理后广泛传播到全身，从而到达感染部位。它们的微小尺寸允许它们渗透到药物分子无法穿透的区域，例如血脑屏障。一些噬菌体甚至能够渗透和破坏生物膜[14]。一旦在感染部位，噬菌体的指数增长可能会比抗生素治疗所需要的治疗次数少，且剂量更低。

同时噬菌体对宿主菌有依赖性，只在宿主菌感染部位发生作用，并在宿主菌体内迅速增殖，能在细菌感染的整个过程中发挥作用，随着宿主菌的清除而死亡，不会在体内残留[15]。另外，根据 Carlton 的报道，烈性噬菌体通过在细菌体内的不断复制和循环代谢到很长时间之后能够对相应细菌产生适应性的变异从而变的能够裂解更多的细菌，但是自身依旧具有对细菌强烈的裂解能力，这也就意味着噬菌体的适应能力和感染效率能够得到提高，而传统抗生素不具备这种优势。

而且噬菌体治疗现在不仅局限于自己本身治疗，其表达的裂解酶也是一种很好的治疗手段。噬菌体裂解酶是由噬菌体感染细菌的后期由噬菌体基因组编码合成的一种细胞壁水解酶，有选择性、快速的杀灭特定的革兰氏阳性细菌[16]。肽聚糖作为革兰氏阳性菌细胞壁的重要组成部分，对维持细菌内部的正常渗透压起着至关重要的作用，如果肽聚糖遭到破坏可以直接导致细菌的渗透性损伤和细菌崩解。而且裂解酶用于治疗具有以下几点优势：第一，具有高度的特异性，大多数具有种属特异性，这主要是由于不同细菌细胞壁上的肽聚糖成分有差异；第二，具有快速、高效的特点，一旦裂解酶与肽聚糖上的底物接触，就可以在极短的时间内将处于静态或生长状态的细菌杀灭；第三，可以有效的治疗生物被膜引起的心内膜炎等感染；第四，可以与针对细胞壁起作用的抗生素发挥协同作用；第五，可以使抗性菌株恢复对抗生素的敏感性[17]。

3 噬菌体治疗的缺点

3.1噬菌体方面 尽管使用噬菌体作为抗菌素治疗有明显优势，但也有不少挫折。其中之一是缺乏适当记录的临床研究。目前还没有关于治疗方法、剂量、频率和持续时间的既定协议。我们对噬菌体体内行为的了解非常有限。已经有人提出，在人体内部，网状内皮系统可能会显著减少噬菌体的数量，从而减少与病原体对抗的可能性[18]。此外，噬菌体中和抗体的出现可能会阻碍噬菌体对抗目标细菌病原体的能力。在波兰，对57例细菌感染患者进行的一项研究记录了这一现象，在对噬菌体进行了肠道辅助治疗，这项研究在当地和口服药期间是否会发生还没有定论。从理论上讲，噬菌体中和抗体的发展不应成为噬菌体治疗的重要障碍，因为噬菌体的吸附和裂解动力学应该比宿主的抗体产生更快。另一个问题是噬菌体处理细胞内病原体的功效。尽管如此，据报道，噬菌体成功地预防了沙门氏菌病和沙门氏菌生物膜产生[19]。长期的噬菌体治疗的副作用仍然未知。此外，没有足够的质量控制数据，噬菌体制剂的纯度和稳定性是可疑的。安全和语言障碍阻碍了科学家在俄罗斯和波兰的期刊上解释实验程序。自然，噬菌体在它们的目标宿主范围内是高度特异性的，它可能包括整个物种的成员，或者是一个物种内的一些菌株。这一特性既有消极的方面，也有积极的方面，它有助于避免对微生物群落的负面影响，以及在发现和消灭目标病原体方面的障碍。检测一种可能导致患者病情恶化的病原体，是需要耗费大量时间的。使用噬菌体鸡尾酒，它包含许多不同的噬菌体，涵盖了广泛的潜在毒株，是解决这一问题的一种方法。用于噬菌体治疗的噬菌体应仅由毒性噬菌体，而非温带噬菌体组成，以避免致病性特征的水平转移[20]。了解许多不同类型的噬菌体的确切行动模式并不是一件简单的事情，因为噬菌体在体内条件下的表现可能与体外的不同。在孟加拉国进行的一项针对急性细菌性腹泻儿童的随机试验表明，口服的噬菌体未能在肠道内扩增，导致腹泻发作的发生没有改变[21]。为了阐明噬菌体在体内的作用机制，还需要进行更多的噬菌体治疗试验和药物动力学研究。

3.2细菌方面 正如细菌可能对抗生素产生抗药性一样，它们也可能通过一系列机制对噬菌体产生抗药性。这些包括在细菌细胞上对噬菌体表面受体进行修饰，将噬菌体的基因组与细菌的基因组整合，并丢失特定于噬菌体复制或组装的基因[22]。具有机制如下：

3.2.1物理阻隔 细菌细胞外结构不仅有利于细菌在恶劣环境中存活，对阻止噬菌体侵染也起一定作用。如某些固氮菌可产生藻酸盐，增加细菌对噬菌体的抵抗。此外，许多细菌的荚膜如链球菌中的透明质酸也可以抵御噬菌体的侵蚀[23]。

3.2.2吸附抑制 噬菌体吸附宿主菌的部位和受体不同，由此决定了噬菌体的宿主特异性。这些受体包括细菌表面的磷壁酸、多糖、脂多糖或蛋白质等。还有一些噬菌体吸附于宿主菌的菌毛，如铜绿假单胞菌噬菌体 MPK7 和 M22 可以利用Ⅳ型菌毛作为它们的受体，当铜绿假单胞菌缺乏 pilA 基因时，可以产生对噬菌体 MPK7 和 M22 的抵抗[24]。

3.2.3注入阻滞 注入阻滞是由质粒或前噬菌体编码的蛋白发挥阻滞 DNA 注入宿主菌的作用，是细菌抗噬菌体的第二层手段。温和噬菌体整合入细菌宿主染色质中后，具有抵抗同种或有近缘关系的噬菌体重复感染的能力，这个过程称为超感染排除(superinfection exclusion，Sie)[25]。

3.2.4限制—修饰系统(Restriction-Modification，R-M)是细菌一种广泛地针对靶向DNA的免疫系统。到目前为止，在已测序的细菌和古细菌的基因组中，超过 90% 都含有 R-M系统[26]。

3.2.5流产感染系统 流产感染(abortive infection，Abi)是指当噬菌体成功注入 DNA 后，其繁殖受到阻断，导致子代噬菌体繁殖和释放失败，从而避免其他细菌被噬菌体感染。与其他抵抗机制相比，这种系统在摧毁噬菌体的同时最终会导致宿主细菌的死亡，但是通过这种牺牲个体的方式可以保护细菌群体[27]。

3.2.6CRISPR-Cas系统CRISPR在近一半细菌和所有的古细菌中都存在。CRISPR序列也成为目前基因改造和基因缄默的工程工具[28]。当噬菌体感染细菌，一些细菌会在靠近 CRISPR 序列前导区处插入一段和噬菌体序列一致的间区序列，当相同噬菌体再次感染时，细菌的CRISPR-Cas相关基因产物(CRISPR-associated proteins)，利用间区序列介导产生一种CRISPR RNA 前体转录子(pre-crRNA)，之后被加工成小的CRISPR RNA 分子(crRNA)，利用类似 RNA干扰(RNA-interference-like)的机制启动诱导细菌崩解入侵的噬菌体核酸[29]。

4 噬菌体在治疗金黄色葡萄球菌感染方面的可行性

4.1细菌方面分析 金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球菌，属于微球菌属[30]。由于其细胞壁结构与革兰氏菌细胞壁的不同，噬菌体对其进行裂解时只需要分泌表达裂解酶就可以对其进行裂解[31]，不需要进行其他步骤。而且金黄色葡萄球菌现在面临的主要问题是抗生素耐药性的产生，还没有细菌产生针对噬菌体裂解酶抗性机制的研究报道[32]。另外，有报道对金黄色葡萄球菌用亚最小抑制浓度的裂解酶时，不会产生对裂解酶表现抗性的突变菌株。在实验中，将噬菌体裂解酶滴到长有金葡菌菌苔的平板上，然后在空斑的边缘处挑取单菌落继续培养后再次涂平板滴裂解酶，如此重复操作40个循环，即便如此，仍然没有抗性菌株出现[33]。在另一项研究中，体外使 MRSA 菌株暴露于递增浓度梯度的特异性裂解酶 Cly S 或者莫匹罗星，结果8d之后产生了具有低水平莫匹罗星抗性的突变菌株，而没有发现对裂解酶具有抗性的突变株。尽管金黄色葡萄球菌可以形成生物被膜，但是这不能阻碍裂解酶发挥其裂解活性[34]。

4.2噬菌体方面分析 细菌进化的同时，噬菌体也跟着细菌进化。如面对固氮菌产生的藻酸盐，噬菌体F116 会产生一种藻酸盐裂解酶，解除藻酸盐的物理阻隔。一些噬菌体还可以通过产生多糖裂解酶或多糖水解酶来裂解胞外多糖(EPS)[35]，消除生物膜的阻碍作用。噬菌体还可通过多种方式逃避 R-M系统，如靶序列突变、抑制限制性内切酶、合成可以水解 R-M因子的酶 (如 AdoMet )。博得特菌(Bordetella spp)噬菌体编码自身甲基转移酶差异反转录因子 (diversity-generating retroelements，DGRs)，通过 DGRs使噬菌体与不同的细菌表面结构相互作用，促进噬菌体的吸附。面对流产感染机制，噬菌体orf38 基因的突变可以使其避免AbiQ[36]。对于CRISPR-Cas免疫而言，噬菌体仅通过原型间隔序列单点突变可克服这种免疫，如噬菌体通过自身编码CRISPR-Cas系统干扰宿主的抗病毒系统，完成裂解循环[37]。

5 结论与展望

随着金黄色葡萄球菌耐药性越来越严重，人们急需一种新的治疗手段来对付金黄色葡萄球菌。通过对噬菌体治疗的优缺点分析以及治疗可行性分析，我们不难发现，虽然噬菌体治疗存在一定的风险，但是其治疗的优越性是显而易见的，如果我们的研究技术能够更先进，未来噬菌体治疗金黄色葡萄球菌感染方面将得到很好的应用。而且现在人们将目光更多的聚焦于裂解酶治疗，其作为一种蛋白，具有更广的宿主谱，且不易产生抗性，同时更容易研发成制剂，配合抗生素使用，将会有很好的效果，也是未来研发的一个主方向。