GTP酶Rab25在结直肠癌化疗耐药中的作用研究

谢竹夫 黄启友 姚菲 周川人 黄晓颖 王强 吴清明

1武汉科技大学医学院（武汉 430070）；2职业危害识别与控制湖北省重点实验室（武汉 430070）；3武汉科技大学附属天佑医院（武汉 430061）

结直肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一［1］，目前的治疗手段包括外科手术、放疗、化疗以及靶向治疗，对于中晚期或者转移的结直肠癌，以化疗为主的治疗方法是更好手段之一［2-3］，主要化疗药物是5-氟尿嘧啶（5-Fu）和顺铂（DDP），耐药性问题仍然是癌症复发和转移的首要原因［4-6］，目前关于结直肠癌耐药的机制尚未明确，结直肠癌对化疗药物的耐药涉及许多基因的变化，从中找出关键的耐药基因是亟需解决的问题。GTP酶Rab家族与肿瘤耐药密切相关，有研究［7］表明，沉默Rab25的肺癌细胞对厄洛替尼的敏感性增加，而在卵巢癌A2780细胞系中过表达Rab25可诱导对顺铂的耐药性［8］，本研究利用构建的结直肠癌耐药株，试图探讨Rab25与结直肠癌化疗耐药之间的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞及材料 结直肠癌细胞株HCT-8购自中国武汉细胞典藏中心，耐药株由湖南丰晖生物科技有限公司对亲本株诱导产生；5-Fu和DDP购自Sigma-Aldrich公司；Rab25蛋白抗体购自Cell Signaling Technology公司；Rab25引物（Forward：GGT GGT GCT GAT CGG CGA ATC；Reverse：CAG TGC GGG TGG AGA ACT CAA C）由生工生物工程股份有限公司设计及合成。人Rab25基因ORF克隆质粒、pCMV3-C-FLAG空载和Sinofection转染试剂购自Sino Biological公司。

1.2 实验方法

1.2.1 耐药细胞株构建 本研究采用大浓度药物冲击结合药物浓度递增法诱导构建耐药细胞株，5-Fu诱导药物浓度分别为1、2、4、6、8、10 μg/mL，DDP 诱导药物浓度分别为 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 μg/mL。步骤如下：用含有胎牛血清的RPMI-1640的培养基分别配制浓度为20 μg/mL的5-Fu溶液和2 μg/mL的DDP溶液，待结直肠癌亲本株HCT-8生长至对数生长期，再按上述浓度梯度增加DDP或5-Fu剂量。依此类推，直到细胞可以在10 μg/mL 5-Fu和1 μg/mL DDP中稳定生长和传代。将耐受DDP与5-Fu的HCT-8命名为HCT-8/DDP和HCT-8/5-Fu。

1.2.2 细胞培养 HCT-8结直肠癌细胞株使用含10%胎牛血清培养基在细胞培养箱中培养，HCT-8结直肠癌细胞5-Fu和DDP耐药株使用含有对应的5-Fu或者DDP的10%胎牛血清培养基在细胞培养箱中培养以维持细胞耐药性，培养条件为37℃，5% CO2。

1.2.3 MTT比色法 待细胞生长至对数生长期，铺96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液（约5 000个细胞）；常规培养，次日加入0、5、10、15、25、50 μg/mL浓度的 DDP，5-Fu 为 0、5、10、20、40、80 μg/mL，HCT-8/DDP培养 24 h或 48 h，HCT-8/5-Fu培养48 h或72 h，加入MTT溶液，孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，避光摇匀，放酶标仪测定吸光度，波长490 nm。

1.2.4 全转录组测序 全基因组测序是对未知基因组序列的物种进行个体的基因组测序，通过全转录组基因测序比对结直肠癌正常株及耐药株之间RNA水平差异，筛选与结直肠癌耐药相关的GTPase Rab家族基因，测序实验步骤流程为：（1）RNA样本纯度、浓度检测；（2）mRNA富集及反转录；（3）末端修复、3′端加A；（4）接头链接、片段选择；（5）PCR富集；（6）文库质控；（7）上机测序。使用FPKM来表达各基因的表达水平。

1.2.5 生物信息学分析 基于癌基因图谱TCGA数据库中的结直肠癌的TCGA-COAD数据集，使用GEPIA在线工具对Rab25与结直肠癌的生存期和耐药标志性蛋白进行关联性分析，具体步骤如下：TCGA下载结直肠癌TCGA-COAD数据集，提取Rab25的表达数据及临床预后信息，将COAD患者分为Rab25高表达和低表达两组，使用Kalpan-Meier（KM）统计方法分析两组间总生存期（OS）和无疾病生存期（DFS）。通过查阅相关文献和检索NCBI Gene库，确定结直肠癌耐药相关性蛋白，使用GEPIA在线基因关联性分析工具分析Rab25与结直肠癌耐药相关性蛋白的相关性。

1.2.6 RT-PCR 引物设计合成后，先提取细胞总RNA并测定浓度，合成cDNA并进行逆转录，每个样本设3个复孔。每个样转录体系为5×RT Buffer 2 μL，Enzyme 0.5 μL，Primer 0.5 μL，逆转录完成后进行PCR扩增，扩增体系为SYBR 5 μL，Forward primer 0.5 μL，Reverse primer 0.5 μL，Diluted cDNA 4.5 μL，扩增程序为：Hold（预变性）；95 ℃，30 s，40 Cycles；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，扩增时间约为101 min。扩增结束后，使用ΔΔCT法计算实验组和对照组RNA表达差异倍数。

1.2.7 免疫蛋白印迹 用1%PMSF RIPA细胞裂解液提取总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，按上样量制备上样样品，制备15%的分离胶和5%的浓缩胶，每孔加20 μg样品进行电泳，结束后再用恒流0.3 A于冰上2 h电转，取出PVDF膜，TBST洗涤3次，5%封闭液室温封闭2 h。Rab25蛋白抗体稀释比例为1∶5 000，β-actin蛋白抗体稀释比例为1∶10 000，一抗4℃，孵育14TBST洗涤3次；孵育二抗，二抗稀释比例为1∶5 000，室温孵育1 h，TBST洗涤3次；放入ChemiDocTM XRS+成像系统成像，显影观察。

1.2.8 流式细胞术检测细胞周期和凋亡 转染48 h后的细胞加入药物处理，药物作用特定时间后终止培养，收集细胞。细胞固定，预冷的1×PBS洗涤收集的细胞3次，收集细胞沉淀，弃上清，加入适量体积预冷70%乙醇4℃过夜固定。细胞染色：预冷PBS溶液洗涤，加入适量体积400 μL CCAA溶液，避光孵育30 min。以标准程序使用Accuri C6流式细胞仪检测，细胞周期结果用Modfit LT.0进行拟合，凋亡结果用FlowJo 10.7.2进行分析。凋亡不需要酒精固定直接采用Annexin V-FITC/PI双染色法染色后上机检测。

1.3 统计学方法 使用SPSS 22.0数据分析软件对数据进行统计分析，实验涉及的所有计量资料均采用均数±标准差进行描述，两个样本均数间的差异比较使用t检验，三个样本间的及以上均数间的比较使用多因素方差分析进行比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 直肠癌细胞耐药时形态发生变化 倒置相差光学显微镜下，见亲本株与耐药株均呈单层贴壁生长，高倍镜下见耐药株细胞多呈不规则卵圆形或菱形，细胞核大，细胞质颗粒较为疏散，而亲本株HCT-8细胞多为呈长条梭形，细胞核相对较小，细胞质颗粒紧密，3种细胞核仁折光性相当，见图1。

图1 耐药株与HCT-8亲本株形态学差异比较（倒置相差显微镜）Fig.1 Morphological comparison of the chemoresistance colorectal cancer cell line（inverted phase contrast microscope）

2.2 耐药株细胞鉴定 用不同浓度梯度抗癌药物处理亲本株和耐药株细胞，一定时间后计算各个浓度细胞存活率及耐药指数，结果显示，耐药株对应相同浓度的细胞存活比率比较均比亲本株高（P＜0.05）。HCT-8/DDP的24 h和48 h耐药指数分别为3.45和5.26，HCT-8/Fu的48 h和72 h耐药指数分别为5.55和7.27，见图2。

图2 抗癌药物处理结直肠癌耐药细胞存活曲线Fig.2 Cell survival curves of chemoresistance cell strains treated with DDP or 5-Fu

2.3 GTP酶Rab家族在耐药株细胞表达发生变化 全转录组测序筛选结果显示，在筛选的可能与耐药相关的GTP酶Rab家族目的基因中，至少有5个差异具有统计学意义（P＜0.001），其中，比起结直肠癌HCT-8亲本株，HCT-8/DDP的Rab25、Rab32和Rab38基因表达水平均显著降低，降低倍数分别为12.36、7.10和7.15倍，HCT-8/Fu降低倍数分别为10.29、7.40和5.88倍（P＜0.001）。由于Rab25在囊泡运输起关键作用以及其差异最为显著，在后续的实验中我们选择了Rab25作为研究重点，见表1。

表1 亲本株与耐药株GTP酶Rab家族相对表达Tab.1 GTPase Rab family expression of HCT8 strain and drμg-resistant cells

2.4 Rab25与结直肠癌患者预后及耐药蛋白有关 为初步评估Rab25在结直肠癌中的临床价值，利用GEPIA基因表达谱交互分析TCGA数据库中的TCGA-COAD数据集及基因关联性，共筛选104例COAD关于Rab25表达的临床数据，结果表明，Rab25与结直肠癌的总生存期存在相关性（图3），高表达Rab25的结直肠癌患者总体生存期更长（HR=0.4，P＜0.05），并且Rab25在结直肠癌患者中的表达与结直肠癌耐药标志蛋白abcb1、abcc1和abcg2均呈负相关（P＜0.01）。

图3 Rab25表达与患者预后和多药耐药标志物相关Fig.3 Rab25 expression is associated with patient prognosis and multidrμg resistance markers

2.5 耐药细胞Rab25表达鉴定及调控 耐药株Rab25的RNA表达水平和蛋白表达量均低于亲本株HCT-8（P＜0.001）。Rab25质粒转染48 h之后，比起转染空载的阴性对照组（NC），HCT-8/DDP和HCT-8/Fu的Rab25的RNA表达水平分别是其（31.79±3.19）和（23.58±2.58）倍（图4），蛋白相对表达量较NC均明显增高（P＜0.001）。

图4 耐药株转染Rab25质粒的表达水平Fig.4 The expression level of Rab25 in chemoresistance cell strains

2.6 上调Rab25增加结直肠癌耐药株细胞对药物的敏感性 过表达Rab25之后，用梯度浓度抗癌药物处理耐药株一定时间，MTT结果显示，过表达Rab25显著降低耐药株的细胞存活率（P＜0.01），上调Rab25的HCT8/DDP相对于转染空载的24 h和48 h耐药指数分别为0.40和0.38，上调Rab25的HCT8/Fu相对于转染空载的48 h和72 h耐药指数分别为0.21和0.23（图5）。

图5 结直肠癌耐药细胞株上调Rab25的细胞存活曲线Fig.5 The cell survival curve of colorectal cancer chemoresistance cell lines treated with anticancer drμgs after Rab25 was up-regulated

2.7 上调Rab25增强药物对细胞G0/G1期的阻滞转染Rab25质粒和空载48 h后，用0、10、50 μg/mL浓度DDP处理HCT-8/DDP细胞12 h，0、20、80 μg/mL浓度5-Fu处理HCT-8/Fu细胞48 h，流式结果显示，比起转染空载的细胞，转染Rab25的细胞表现出G0/G1期阻滞，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2-3。

表2 DDP处理后的细胞周期Tab.2 Cell cycle under treatment of DDP ±s

表2 DDP处理后的细胞周期Tab.2 Cell cycle under treatment of DDP ±s

注：与NC组比较，*P＜0.05

NC pCMV3-Rab25-Flag细胞周期SubG1（%）G0/G1（%）S（%）G2/M（%）0 μg/mL 2.34±0.18 23.59±1.79 47.01±2.74 27.18±0.99 10 μg/mL 3.11±0.57 33.00±1.23 34.59±2.71 29.17±1.47 50 μg/mL 3.07±0.12 34.92±2.19 27.48±2.01 35.65±3.35 0 μg/mL 1.97±0.27 25.24±2.14 44.55±2.85 28.21±1.41 10 μg/mL 5.11±0.29 46.67±3.02*28.11±1.84*20.87±0.65*50 μg/mL 4.21±0.15 48.81±3.37*21.99±2.29*26.08±2.43*

表3 5-Fu处理后的细胞周期Tab.3 Cell cycle under treatment of 5-Fu ±s

表3 5-Fu处理后的细胞周期Tab.3 Cell cycle under treatment of 5-Fu ±s

注：*P＜0.05 vs.NC

Phase NC pCMV3-Rab25-Flag SubG1（%）G0/G1（%）S（%）G2/M（%）0 μg/mL 1.12±0.16 23.18±1.86 44.25±4.23 31.57±2.14 20 μg/mL 2.98±0.54 24.34±1.51 40.57±3.08 33.09±2.11 80 μg/mL 4.47±0.39 31.56±1.78 36.77±2.48 28.31±1.09 0 μg/mL 1.83±0.16 24.77±1.87 42.89±3.01 30.53±1.08 20 μg/mL 10.09±0.17 39.18±2.53*29.162±2.03*22.57±1.73*80 μg/mL 9.13±1.70 42.46±2.90*28.18±2.18*19.40±1.67*

2.8 上调Rab25增强药物的致细胞凋亡作用 转染Rab25质粒和空载48 h后，用0、10、50 μg/mL浓度DDP处理HCT-8/DDP细胞12 h，0、20、80 μg/mL浓度5-Fu处理HCT-8/Fu细胞48 h，流式结果显示，比起转染空载的细胞，转染Rab25的细胞凋亡率显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.001，图6）。

图6 上调Rab25对结直肠癌耐药细胞耐药时细胞凋亡的影响Fig.6 Rab25 affects the cell apoptosis of colorectal cancer chemoresistance cells during chemotherapy resistance.

3 讨论

耐药的发生发展是一个极其复杂的过程，其中包括微环境和细胞遗传物质的改变［9-10］。目前国内外结直肠癌耐药基因研究仍然有限，寻找新的克服结直肠癌耐药基因靶点至关重要。已有研究证明了GTP酶家族如rho A、rho B、rho E等突变在介导癌症化疗耐药中的作用，它们可通过介导细胞膜转运蛋白、凋亡相关蛋白的表达影响肿瘤细胞对多种化疗药物的耐药性［11］，但涉及结直肠癌症耐药的研究较少。

根据LONGDEN等［12］的研究，推测细胞形态改变有利于癌细胞减少与抗癌药物的接触并将药物排出。细胞的增殖能力与耐药指数也证明DDP和5-Fu耐药株对抗癌药物具备良好的耐受能力。

结合全转录组测序、ZHENG等［13］和GARDAMA等［14］的研究来看，GTP酶Rab家族在耐药过程中变化显著，值得一提的是，这种变化在不同的耐药株里面的变化一致，这提示在结直肠癌多药耐药中，它们可能以同样的机制介导不一样的抗癌药物耐药。有研究［15］表明Rab25在多种癌症中与囊泡运输有着密切的关系，充当着将药物运送到细胞内的关键因子，后续利用TCGA-COAD数据集筛选其相关的结直肠癌临床数据，生物信息分析初步显示了Rab25表达与结直肠癌预后和多药耐药蛋白的关联性。细胞学实验表明，Rab25的mRNA和蛋白水平都在结直肠癌耐药细胞中显著降低，通过调控Rab25表达，Rab25上调逆转了结直肠癌细胞的耐药性。

为进一步探究Rab25影响结直肠癌细胞化疗耐药作用，检测了上调Rab25对结直肠癌耐药株细胞耐药时的细胞周期和细胞凋亡的影响，有研究显示，miRNA可通过增加G0/G1期、降低S期和G2/M期细胞提高结直肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性［16］，但本研究发现，在加入DDP或者5-Fu作用一定时间后，S期细胞降低减少，这说明药物本身影响了耐药细胞的DNA合成，这是由药物的作用机制决定的，增多的G0/G1期细胞意味着停止分裂的细胞增多，这可能与细胞开始“疲于应对”抗癌药物的杀伤作用有关。

此外，抗癌药物本身可通过诱导细胞凋亡杀伤细胞，但耐药细胞能阻止此过程发生［17］，而上调Rab25表达使得抗癌药物重新增强细胞的致凋亡作用，尤其表现在晚期凋亡，这种效应在给予高浓度药物处理时更加显著，这与其影响直肠癌细胞耐药过程中SubG1期的增高一致，因为SubG1期的细胞增多一般意味着凋亡细胞增多，不过，更深的分子机制需要进一步探索。

综上，本研究利用构建的结直肠癌耐药细胞，证实了Rab25是克服结直肠癌DDP和5-Fu耐药的关键基因。这可为临床解决结直肠癌耐药问题提供新的理论基础，为开发针对Rab25或其他Rab家族靶点的治疗策略提供新的思路。