电针对帕金森模型小鼠GLP-1R介导的PI3K/AKT/GSK-3β信号通路的调控作用

李含章 祁羚 张小蕾 陈祥林 郭磊 郭淑琴 马骏

湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心（武汉 430060）

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一种好发于中老年人的慢性进行性中枢神经系统疾病，PD发病主要表现为静止性震颤、肌强直、体位障碍等运动功能障碍［1］。目前，医学界对于PD的发病原因和机制尚未完全阐明。研究［2］发现，胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是机体胃肠道L细胞释放的一种胃肠道激素，可穿过血-脑脊液屏障，通过与胰高血糖素样肽1受体（glucagonlike peptide-1 receptor，GLP-1R）结合发挥多种生物效应，在PD、阿尔茨海默病、外周神经病变、脑卒中等疾病中具有一定的神经保护作用。由此可见，GLR-1R信号通路在PD发生、发展过程中介导了重要的调节机制，为治疗PD提供了潜在的治疗靶点。前期研究［3-6］已证实，针刺能够通过释放兴奋性氨基酸、抑制氧化应激反应、调控泛素一蛋白酶体系统、促进线粒体功能恢复等机制改善行为学症状，发挥神经保护作用，但电针通过GLP-1R介导的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinosiyol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）信号通路改善PD运动功能障碍的研究报道相对较少。本研究拟从黑质（substantia nigra，SN）GLP-1R介导的PI3K/AKT/GSK-3β信号通路角度，探讨电针对PD小鼠的作用机制，为临床应用电针治疗帕金森提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 本研究采用48只SPF级C57/BL6雄性小鼠（7～8周龄，由湖北省实验动物研究中心购进，动物许可证编号：SYXK（鄂）2017-0067），喂养于标准动物房，室温22～25℃，湿度45%～55%，小鼠可自由摄食和饮水，适应性喂养1周，按随机数字表法分为正常组（normal control group，NC）、模型组（model group，M）、电针组（electroacupuncture group，EA）、抑制剂组（DPP-inhibitor group，DI），每组12只。

1.2 主要试剂与仪器 鱼藤酮、羧甲基纤维素、DPP-4抑制剂利格列汀（阿拉丁试剂有限公司），TH（博士德生物工程有限公司），兔多抗p-PI3K、p-GSK-3β、小鼠单抗GSK-3β（abcam公司），兔多抗PI3K、p-AKT、AKT（江苏亲科生物研究中心有限公司），兔单抗GLP-1R（武汉三鹰生物技术有限公司），兔多抗GAPDH（杭州贤至生物有限公司），敞箱实验装置（武汉一泓科技有限公司），0.25 mm×15 mm针灸针（北京中研太和），SDZ-Ⅱ型电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）。

1.3 模型制备方法 采用鱼藤酮连续灌胃制备PD小鼠模型［7］：将鱼藤酮溶于4%羧甲基纤维素和1.25%氯仿溶液的混合液中，按体质量10 mg/kg给药，每日1次，连续灌胃4周。正常组以同体积生理盐水灌胃，1次/日，共4周。

1.4 干预方法 NC组：予以同体积生理盐水灌胃4周后，使用同规格的固定台捆绑，30 min/次，1次/日，共2周。M组：予鱼藤酮连续灌胃4周后，使用同规格的固定台捆绑，30 min/次，每日1次，共2周。EA组：予鱼藤酮连续灌胃4周后，进行电针干预治疗。将小鼠捆绑于固定台后，参照《常用实验动物穴位定位图谱》选取“风府”、“足三里”（双侧）、“太冲”（双侧），使用0.25 mm×15 mm一次性针灸针，于“风府”“太冲”直刺3 ～ 5 mm、“足三里”直刺6 ～ 8 mm，针柄连接SDZ-Ⅱ型电子针疗仪，正极接“风府”穴，负极接“太冲”穴，连续波，电压1.6 V，强度1 mA，频率2 Hz，以穴位出现局部颤动为佳，30 min/次，1次/日，共治疗2周。“风府”为固定用穴，“太冲”、“足三里”隔日左右交替使用。DI组：予鱼藤酮连续灌胃4周后，采用二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）抑制剂利格列汀［8］［10 mg/（kg·d）］连续灌胃2周，同时使用同规格的固定台捆绑，30 min/次，每日1次，共2周。

1.5 标本采集 各组小鼠在敞箱实验结束后即刻取材。每组任取6只小鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用4%多聚甲醛灌注固定后取出中脑组织，另6只麻醉后冰上取出新鲜脑组织，留取中脑黑质区域组织块，置于-80℃冰箱中保存。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 敞箱实验检测各组小鼠自主运动的变化情况 各组小鼠于治疗结束后次日进行敞箱实验。设置测试总时间为5 min，将小鼠置于反应箱适应5 min后开始计时，观察各组小鼠自主运动的总路程、总时间、平均速度的变化情况。

1.6.2 免疫组化法测定中脑黑质中酪氨酸轻化酶（tyrosine hydroxylase，TH） 表达中脑黑质组织采用4%多聚甲醛中固定后，制备厚度为4 μm的石蜡切片。石蜡切片经脱蜡水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶后，山羊血清室温封闭30 min，TH抗体（1∶200）孵育过夜，二抗孵育20 min，再经DAB显色、苏木素复染、脱水、封片后，采集图像。每张切片选取3个400倍的图像，采用Image pro plus 6.0软件计算平均吸光度。

1.6.3 Western blot测定 GLP-1R、PI3K，AKT，GSK-3β蛋白表达水平 取中脑黑质组织20 mg，加入200 μL RIPA裂解液匀浆、裂解后离心（12 000 g，4℃，10 min），取上清液，BCA法测定所提取总蛋白浓度后，将蛋白上清与5×Loading buffer混合，煮沸10 min进行蛋白变性。每组取40 μg总蛋白于PAGE凝胶电泳分离后转膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭（磷酸化蛋白用1%的BSA封闭）后，加入GLP-1R（1∶500），p-PI3K（1∶1 000），PI3K（1∶500），p-Akt（1∶500），Akt（1∶500），p-GSK-3β（1∶500），GSK-3β（1∶1 000）一抗4 ℃孵育过夜。洗去一抗，加酶标二抗（1∶50 000）37℃孵育2 h，加入ECL显色，采用IPP分析进行相对定量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 20.0进行数据处理，所有数值采用（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量变化 第4周，与NC组比较，M、EA和DI组鱼藤酮造模后小鼠体质量显著降低（均P＜0.05）。第6周，M、EA和DI三组组间比较体质量差异无统计学意义，见图1。

图1 体质量变化Fig.1 Changes of body weight in each group

2.2 各组小鼠自主运动能力比较 与NC组比较，M组小鼠自主运动的总路程缩短、总时间缩短、平均速度降低（均P＜0.01）。与M组比较，EA和DI组小鼠自主运动的总路程延长（均P＜0.01）、总时间延长（P＜0.01，P＜0.05）、平均速度升高（均P＜0.01），且与DI组比较，EA组小鼠的总路程延长和运动总时间延长（均P＜0.01）。见图2、3。

图2 小鼠的自主运动轨迹图像Fig.2 Autonomous motion track image of mice

图3 各组小鼠自主运动的总路程、总时间、平均速度比较Fig.3 Comparison of total distance,total time and average speed of autonomous movement of mice in each group

2.3 各组小鼠中脑黑质TH表达水平比较 图中箭头所指为中脑黑质典型的TH阳性神经元，阳性着色为棕黄或棕褐色。与NC组比较，M组小鼠中脑黑质TH平均吸光度显著降低（P＜0.01）；与M组比较，EA和DI组小中脑黑质TH平均吸光度均显著升高（均P＜0.01）。EA组与DI组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），见图4。

图4 各组小鼠中脑黑质TH阳性表达比较（×400）Fig.4 Comparison of TH positive expression in SN of mice in each group（× 400）

2.4 各组小鼠GLP-1R、PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表达水平比较 与NC组比较，M组小鼠中脑黑质 GLP-1R，p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT，p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达水平显著增高（P＜0.01）。与M组比较，EA和DI组GLP-1R，p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT蛋白表达水平显著升高（均P＜0.01），p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。EA组与DI组比较，上述各个指标差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图5。

图5 各组小鼠GLP-1R、PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表达水平比较Fig.5 Comparison of protein expression levels of GLP-1R,PI3K,Akt and GSK-3β in each group

3 讨论

GLP-1R是G蛋白偶联受体超家族成员之一，广泛表达于中枢神经系统［9-10］。相关研究表明，GLP-1R激动剂在神经退行性疾病和糖尿病的动物模型中通过激活参与细胞增殖、生长、存活和修复的通路发挥神经保护作用［11-12］。研究证实，GLP-1R可激活PI3K/AKT通路发挥抗凋亡和神经保护等重要作用［13］。PI3K通过磷酸化AKT蛋白Ser473位点使AKT活化，而活化后的AKT通过p-GSK-3β的Ser9位点抑制GSK-3β活性，避免细胞凋亡的发生［14］。在本研究中，鱼藤酮造模后，小鼠黑质中GLP-1R、PI3K、AKT蛋白表达水平显著下降，GSK-3β蛋白表达水平显著上升。DPP-4抑制剂通过抑制DPP-4酶的活性，提高体内GLP-1浓度。本研究采用DPP-4抑制剂利格列汀对PD小鼠进行连续2周灌胃的治疗。经治疗，利格列汀可以有效提高GLP-1R、PI3K、AKT蛋白表达水平，并显著降低GSK-3β蛋白表达水平。同时，电针亦可上调GLP-1R、PI3K、AKT及下调GSK-3β蛋白表达水平，其干预效果与利格列汀无显著差异，提示电针和利格列汀对GLP-1R介导的PI3K/AKT/GSK-3β通路均具有一定的调节作用，二者的效应机制可能相同。

PD的病理改变主要表现为中脑黑质致密区多巴胺神经元变性坏死，TH水平能反映出脑内多巴胺神经元的合成量［15-17］，从而可反映PD的病理改变和损伤的程度。研究［18］表明，针刺可明显改善帕金森病患者黑质致密带。在本研究中，鱼藤酮造模后，小鼠中脑黑质TH表达水平均显著降低，表明PD模型制备成功。经电针和DPP-4抑制剂干预后，中脑黑质TH水平均显著升高，表明电针和DPP-4抑制剂可有效提高PD小鼠的中脑黑质TH表达水平。同时，各组小鼠自主运动能力的变化趋势与TH基本相一致。电针和DPP-4抑制剂可改善PD小鼠的各项行为学表现指标，且电针的干预效果更优。

近来研究显示，GLP-1R的调控还存在多种途径，如小鼠的神经营养通路被激活，凋亡信号被抑制［19］。此外，GLP-1/GLP-1R还通过激活环磷酸腺苷、蛋白激酶C，证明了在各种组织中增强抗氧化能力的效果［20］，PI3K/AKT/GSK-3β 通路仅是其中一个分支，各信号转导通路之间常有交叉。综上所述，电针治疗PD的作用机制可能与GLP-1R介导的PI3K/AKT/GSK-3β通路有关，具体机制有待更深入的探究。